共同研究・競争的資金等の研究課題

• 基盤研究(A), 2012年04月01日 - 2017年03月31日, 24240098, ＤＮＡ修復分子群のエピジェネティック解析と食健康, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 47450000, 36500000, 10950000, 食物成分が遺伝子のエピジェネティックな変化を介して癌やアレルギーなど各種疾患の病態改善に寄与できる例を示した。食要因でのDNA損傷やエピジェネティックな制御が報告されているが、これら分子群遺伝子に着目し、DNA修復分子群の遺伝子発現の制御や変化がどのようなメカニズムで起こるのかをエピジェネティックな解析を加え、食環境との関わりを明らかにした。メチル化の過剰もしくは過少はいずれも発がんなどと関わることも明らかになっているが、特にがん抑制遺伝子（BRCA1・PTEN・p53など）もしくはそのプロモーターの過剰なメチル化は細胞の悪性化と関連があることを示した。, kaken

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• 挑戦的萌芽研究, 2013年04月01日 - 2016年03月31日, 25560050, 食成分によるＡＫＴシグナル伝達系分子の機能調節解析, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3770000, 2900000, 870000, 種々の食成分によってPI3K/AKTやp38MAPKの活性化がどのように変化するのかを、ラットの骨髄初代培養系や培養細胞系において検討し、RANKLやTNFなどのサイトカイン産生との関わりを明らかにした。また、アルツハイマー病や生活習慣病関連するPTEN遺伝子の発現解析結果を踏まえて効果的な食事のデザインを考案した。さらに食成分による遺伝子発現調節結果を踏まえて、疾患などの予防に食事のデザインを、例えば生活習慣病関連遺伝子の発現解析結果や本研究成果を踏まえて検討し、種々の疾患の治療や予防へと結びつける示唆と考察を総説論文として発表した。, kaken

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• 挑戦的萌芽研究, 2010年 - 2012年, 22650179, 食物成分刺激による摂食関連mRNA・miRNAの発現調節解析, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3320000, 2900000, 420000, 一般に使用される香辛料やハーブなどの成分をターゲットとして、各種標的細胞からどのような摂食関連分子の誘導を引き起こすのか、細胞シグナル伝達にかかわるmRNAやmiRNAの発現を調べ、体内の食欲増進や健康の維持にどのように働くのかを分子生物学的に探究した。例えば種々のローズマリーやセージ刺激などによってAKT1などの遺伝子発現がどのように変化するのかを培養細胞系において検討し、誘導される遺伝子をウエスタンブロッティングや蛍光組織染色などを用いて解析し、摂食システムやそれらの細胞シグナル伝達との関わりを明らかにした。, kaken

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• 基盤研究(B), 2007年 - 2008年, 19300251, プリオン関連蛋白質の解析と食育・食健康, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 18330000, 14100000, 4230000, アポトーシスや細胞膜抗酸化作用との関連を追究するために、プリオン及びドッペルの発現ベクターを作製して、リンパ系細胞に強制発現させ、紫外線照射時や血清除去時のアポトーシスに対する細胞の挙動変化を解析した。プリオン関連蛋白質と微小RNAとの結合の有無を検討したが、特定のRNAとは結合していない。ドッペル蛋白質ではプリオン蛋白質と異なる機能が報告されており、Bcl2関連アポトーシスカスケードの中で機能していることが示唆された。アダプター蛋白質NESHとの相互作用を免疫沈降やウエスタン法で確認した。SOD活性については、WAT1を用いて測定し、ドッペル蛋白質がSOD活性を阻害していることが判明した。, kaken

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• 萌芽研究, 2005年 - 2005年, 17650224, 食生活要因からアプローチするプリオン関連遺伝子産物の機能解析と疾患予防, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3400000, 3400000, 狂牛病の発症機構や診断法の開発に貢献するため、原因に関与するプリオン遺伝子とドッペル遺伝子に着目してその正常機能を追究した。特に、ドッペル遺伝子の機能解析はプリオンの機能解析よりも格段に遅れているがドッペルの解析によってこれらファミリー遺伝子の正常機能が正確に推測されると考え注力した。まずドッペルの遺伝子をヒトリンパ球ライブラリーより単離して、その一部を利用してGST融合蛋白質を精製し、ウサギポリクローナル抗体を作製した。また各種欠失型ドッペル遺伝子発現プラスミッドを構築して、遺伝子発現細胞をクローン化した。これらのシグナル伝達系に関わる分子として以前Tobを発見していたが、その機能解析をRNA結合蛋白質との機能的結合性から追究し論文にした。ドッペルの機能解析過程では、アポトーシス関連のp38やTobとの相互作用の検討は不可欠であると考えている。さて、RNAiや新生ペプチドによる高効率シグナル制御システムを用いれば、細胞外から細胞内シグナル伝達系を制御し得ることから、プリオンやドッペルの遺伝子に対するsiRNA生成システムを構築した。作製したsiRNAが実際に培養細胞系で機能することも確認した。一方、ドッペルやプリオンはカヴェオリンとの関連が強いことの傍証を得たため、現在コレステロール代謝系におけるプリオンとドッペルの機能を、作製したツールを用いて解析している。食生活要因についての検討として、どのような食習慣の改善が望ましいのかについても科学的な研究を行いつつ考察した。その一部を中高生の啓蒙を図るために食育の一環として出版した。, kaken

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• 萌芽研究, 2004年 - 2004年, 16650182, 腸内細菌が健康に与える影響とRNAiを利用した疾患予防, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3500000, 3500000, 最近話題になっているRNAiや新生ペプチドによる高効率シグナル制御システムを用いれば、細胞外からそれらのシグナル伝達系を制御し癌の浸潤・転移を完全に阻止することは充分に期待できる。このRNAiの細胞内のメカニズムの中で中心的役割を果たしているのがHERNA/DICERである。この分子を申請者は最初にクローニングしたので、ひとつにはRNAiのin vivo応用を目指して生体内で有効に働くシステムを構築している。解析への応用として例えば、NESHをこのRNAiを用いて発現抑制をかけると、それに応じて細胞浸潤・転移能が上昇する。SNPs解析結果を踏まえると、CaveolinとNESHにおいて癌に対する効果的なRNAiのデザインが考えられる。このため、これらの分子を標的とした2重鎖RNAの発現ベクターを作製している。また、人工的に合成した2重鎖RNAを用いて細胞内の発現が効果的に抑制されることを確認し、同時に細胞内の2重鎖RNAを効率よく細胞外へ放出させるペプチドを発現するベクターを現在作成中である。これらが有効に働けば癌の効果的な予防に貢献する。そして、RNAiを効率よく無害に働かせるためには、腸内細菌を利用することが考えられたため、腸内細菌の生物的動態をチェックした。まず、腸内細菌と常在菌の増殖抑制をUV照射下と電子レンジを用いて検討した。この結果、UVやマイクロウエーブは相乗効果的に細菌増殖を抑制した。さらに、比較的これらの照射に弱い菌を用いて、菌外に放出するRNAiの合成システムを構築している。, kaken

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• 特定領域研究, 2004年 - 2004年, 16021238, アダプター分子を中心とした発がん及びがん悪性化機構の解析, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 6800000, 6800000, 癌の悪性化阻止の目的で、癌の浸潤・転移能に関連する分子の解析を行った。NESHはSH3領域を有する新しいアダプター蛋白質であるが、Ablチロシンキナーゼに結合し下流へのシグナルを調節しながら細胞運動や浸潤能を負に制御していることを明らかにした。SNPs解析として、主として乳癌の症例90例と肝内結石の症例20例についてCaveolinとNESHについて検討した。乳癌の中のスキルスタイプなど特に悪性例においてCaveolin132プロリンからロイシンへの点突然変異例が見つかったが、これはCaveolinのスカフォールドドメイン領域内であり、シグナル伝達に影響していることが予想されたが、事実この変異をもたらしたカベオリンを発現する細胞膜カベオラ構造は著明に変化することが示された。また、NESHにおいても乳癌の一部にNESH334バリンからアラニンへの点突然変異例が見つかった。この部位はNESHのSH3領域内であり。蛋白質間の結合に影響していることが予想された。外来性のNESHの発現は癌細胞転移を著明に抑制するが、癌細胞増殖には影響しないという結果を得た。中程度の発現が認められる癌細胞のNESH発現をRNAiによって抑制すると顕著な細胞浸潤能の増加が認められた。NESH結合蛋白質の検索により新規分子Tarshを同定していたが、生理的な条件下でin vivoでの結合はほとんど認められなかった。本研究結果から、NESHは細胞運動の制御系で役割を担っていることが明らかになり、NESH・SHPS-1・Caveolin-1など細胞接着や細胞運動に関わる分子の特異的な阻害が癌の浸潤・転移を劇的に抑えることも強く示唆された。, kaken

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• 特定領域研究, 2003年 - 2003年, 15023225, アダプター分子を中心としたがん悪性化機構の解析, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3500000, 3500000, Two-hybrid screening法を用いてNESH結合蛋白質を同定した。この分子は新規分子でありNESHのSH3領域と結合する。この分子TarshとNESHとの結合を検討したが、in vitroでの結合が認められるもののin vivoではその結合は検出されなかった。NESHの発現をサーベイし、多くの高転移性の癌細胞ではNESHがほとんど発現していないことを見い出した。高転移性の癌細胞4種類にNESHを発現させた細胞株を樹立し、その細胞運動能能についてボイデンチャンバー法と金コロイド法を用いて検討した。その結果NESH発現による細胞運動能の抑制が観察された。またヌードマウスを用いたin vivoにおける細胞転移能に対しても同様にNESHは著明にがん転移を抑制した。NESH発現細胞内におけるPAKのリン酸化は著明に減弱しており、NESHとPACの共発現やNESHとPAKとの生化学的な会合が示された。NESHのRNAiを導入した結果、その細胞の浸潤能や運動の亢進が認められ、癌細胞では明らかな転移能の上昇が確認された。本研究結果から、NESHは細胞運動の制御系で役割を担っていることが明らかになった。正常組織の血管内皮細胞や神経細胞でのNESHの発現が比較的高いため、これらの細胞運動や神経突起誘導に関与していることが予想される。事実NESHの発現により細胞増殖因子刺激後の細胞膜ラップリング形成も阻害される。NESHを強制発現させた場合、癌細胞ではその増殖には全く影響しないが、転移能を著明に抑制する。つまり、NESH発現により癌細胞が転移することを抑える。マウスの転移モデルでもNESHのSH3領域の変異はNESHの転移抑制機能を解除した。さらに解析を進めるためにはNESH遺伝子欠損マウスの作製と解析は今後絶対不可欠な課題である。, kaken

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• 基盤研究(B), 1999年 - 2002年, 11470207, チトクロームCオキシダーゼアンチセンスRNAの抗腫瘍効果に関する研究, 白藤 尚毅; 後藤 守孝; 松田 覚; 佐藤 典治; 大井 淳; 井関 徹, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 14500000, 14500000, lipofectin法を用いたMARCO : mitochondrial antisense RNA for cytochrome c oxidaseのin vivo効果の検討。MARCO発現プラスミドをlipofectin法を用いてマウスB細胞白血病株MOPC、T細胞白血病株EL-4、及び骨髄単球性白血病細胞株WEHI-3Bに遺伝子導入を行なった。導入効率は10%程度であったが、in vitroでの細胞死誘導能を細胞数で経時的に観察したところコントロールと比較して有為に減少が確認された。次にin vivoでの後抗腫瘍効果を担癌マウスに腹腔内、及び経静脈投与して観察すると、MARCOをlipofectin法で3日間投与した群では、いずれの細胞の担癌マウスにおいても4週程度の生存率の延長が認められた。2週間投与では、3ヵ月以上の生存延長が観察された。投与量依存性も確認された。生存率の上昇は、経静脈投与、及び白血病芽球腫への直接投与においても同様に観察された。副作用は、lipofectin投与12時間から24時間後の白球数の低下のみで、主要臓器への影響は病理組織像でも認められなかった(白藤、他。投稿中)。次にAdex法を用いたMARCOのin vivo効果をlipofectin法とで比較した。Adenovirus由来cosmid shattle vectorを用いてrecombinant Adex-MARCO virusを作成し、上述のマウス白血病細胞株に対するin vitro遺伝子導入効率は50%程度であった。in vitro, in vivo抗腫瘍効果はliposome法がAdex法にまさっていた(白藤、他。投稿中)。以上の結果よりdrug delivery systemとしてlipofectin法を用いたMARCOの遺伝子治療が白血病に対して有用性を認めることが明らかとなった。
  今後はより副作用の少ないRNAiを用いた遺伝子治療へと発展させていく方針である。, kaken

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• 特定領域研究(C), 2001年 - 2001年, 13214045, 新規アダプター型分子を中心とした発がん機構の解析, 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 名古屋大学, 1800000, 1800000, 細胞仮足形成への関与が示唆される新規アダプター分子NESHを発見し癌研究の視点から申請者らは解析を加えてきた。NESHはSH3領域を有する新しいアダプター蛋白質である。本研究では特にNESHアダプター分子がどのように細胞運動や癌転移の調節に関わっているのかについて解明することを目的としている。NESH類似分子(E3B1/Abi-1,Abi-2,Argbp1)のこれまでの解析結果と一致して、NESHもAblチロシンキナーゼに結合し下流へのシグナルを調節していることや、Racを介したシグナル伝達にも関与していることが明らかになった。NESHの発現は種々の高転移性癌細胞ではほとんど検出されない。また、ヒト染色体上のNESH遺伝子局在領域に一致して癌転移抑制遺伝子の存在が推測された。従ってNESHも癌化や細胞運動調節系で機能を果たしていることが予想され、NESH発現による癌細胞の運動能や転移能への影響について検討した。そして、NESHの発現は癌細胞転移を著明に抑制するが、癌細胞増殖には影響しないという結果を得た。またNESHによる細胞運動能の調節は、PAKキナーゼとの相互作用を介していることが示唆された。Two-hybrid法を用いたNESH結合蛋白質の検索により新たな分子(Tarsh)を同定した。しかし、Tarsh自体の細胞運動に対する影響やNESHとの相互作用について詳細は不明である。正常組織の血管内皮細胞や神経細胞でのNESHの発現が比較的高いため、これら細胞の運動や神経突起誘導にNESHは関与しているのかもしれない。予備的解析によれば、NESHの発現により細胞増殖因子刺激後の細胞膜ラッフリング形成は阻害された。今後は、転移能を持つ癌と持たない癌との比較で、NESHに突然変異や遺伝子欠失が見出されるのか否かを明らかにする必要がある。, kaken

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• 基盤研究(C), 2000年 - 2001年, 12671152, ヒト乳癌および乳腺組織におけるP73、P51/P63遺伝子の機能についての研究, 小田 高司; 梛野 正人; 神谷 順一; 二村 雄次; 松田 覚; 濱口 道成, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 名古屋大学, 3200000, 3200000, ヒト乳癌手術材料を用いてp73遺伝子の機能を解析する為にp73遺伝子が発現している細胞を観察する必要がある。本研究では乳癌組織を用い免疫組織化学的に乳癌組織におけるp73遺伝子の局在を解析した。さらに乳癌細胞におけるp73遺伝子の発現と細胞増殖能、アポトーシスおよぴ臨床的な癌悪性度との関連を検討した。
  【方法】乳房切除術を施行した75症例を対象とし、TSA indirect systemを用いp73染色を行った。細胞核が明瞭に染色された腫瘍細胞が0.5%以上の症例をp73陽性と定義した。
  【結果】筋上皮細胞は75例(100%)においてp73陽性であった。筋上皮細胞と癌細胞を区別するため、抗smooth muscle actin抗体および抗cytokeratin-19抗体を用い二重染色を行った。p73陽性乳癌は15症例(20%)であった。年齢、腫瘍径、リンパ節転移陽性率、エストロゲンレセプター陽性率はp73陽性乳癌群、p73陰性乳癌群における有意差は認められなかった。AI(Apoptotic Indedx)はp73陽性群(中央値2.01%、幅1.14〜6.56%)においてp73陰性群(0.48,0.06〜4.9%)より有意に高値を示した(P<0.05)。また、MI(Mitotic Index)はp73陽性群(2.00,1.08〜3.41%)において陰性群(0.37%,0.01〜2.41%)より有意に高値を示したP<0.05)。p73陽性、高増殖能(MI≧1.0%)群のAI(n=15,中央値2.00%,幅1.08〜3.41%)は、p73陰性群、高増殖群のAI(n=18,1.65%,0.24〜2.41%)、より高い傾向を認めたが有意差は認められなった。1年以内に遠隔転移をみとめた4例はこのp73陰性、高増殖群にふくまれ、アポトーシスの頻度は低かった。p53免疫染色を行い、p53過剰発現は22例(29.3%)に認めた。p73(+)/p53(+)群のAIは2.17%(0.1-3.41%)でp73(-)/p53(+)群の1.12%(0.25-2.40%)より有意に高値を示した。
  【総括】筋上皮細胞にp73遺伝子の発現を認め、筋上皮の分化にp73遺伝子が関与する可能性が示唆された。2.高増殖を示す乳癌においてp73遺伝子のアポトーシス誘導への関与の可能性が示唆された。3.高増殖を示す乳癌においてp73遺伝子の発現低下と遠隔転移能の獲得との関連の可能性が示唆された。4.過剰発現したp53変異蛋白はp73蛋白の機能を抑制しなった。, kaken

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• 2001年, RNA干渉を応用したヒト疾患の予防と治療, 0, 0, 0, 競争的資金
• 2001年, Medical application of RNAi to the human health, 0, 0, 0, 競争的資金
• 特定領域研究(C), 2000年 - 2000年, 12215063, v-Src癌化細胞の浸潤・転移に決定的なシグナル伝達系の研究, 浜口 道成; 岩本 隆司; 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 名古屋大学, 4300000, 4300000, 我々の主な研究対象とする癌遺伝子srcは、元々ラウス肉腫ウイルスの癌遺伝子として同定されたが、最近その癌原遺伝子c-srcの産物c-Srcキナーゼがヒト大腸癌や乳癌で高率に活性化される事、悪性の臨床症状を示す大腸癌症例で、その活性化を生じる欠損変異が高率に見い出され、ヒト癌の浸潤転移に関与するシグナル伝達系を同定する為に、重要なモデル系であると言える。
  我々はまずv-Srcキナーゼによるマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の分泌活性化機構に関して研究を進めた。その結果、v-Src癌化細胞では、MEK1-MAPKシグナル伝達系がMMPの分泌と活性化に決定的なシグナルである事を、ドミナントネガティブMEK1遺伝子を用いて同定した。更に、同様の系が、v-Crk癌化細胞や、ConA刺激細胞においてもMMPの分泌活性化に必須である事を証明した。v-Srcによって転写抑制を受ける遺伝子を調べ、その内のSHPS-1がMAPキナーゼを介して転写抑制され、その強制発現がv-Src癌化細胞の足場非依存増殖を特異的に抑制する事を見い出した。ヒト癌におけるMEK1-MAPKシグナル伝達系と癌化の相関を調べた結果、乳癌細胞、乳癌組織においてMAPキナーゼを活性化させ、細胞の足場非依存増殖を活性化する新規の因子MAWDを同定した。現在その詳細を解析中である。, kaken

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• 基盤研究(B), 1998年 - 2000年, 10557086, ヒト悪性腫瘍のin vitro, in vivoの放射線感受性を規定する遺伝子解明, 中津川 重一; 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 名古屋大学, 12400000, 12400000, 本研究では見いだしたヒト悪性腫瘍におけるin vitroとin vivoの放射線感受性の乖離現象を元に、それぞれの感受性を規定する遺伝子を特定する研究を行った。新規ヒトゲノムをクローニングするために、新たなdegenerative primer法変法を編み出した。すなわち、intercept-PCRによるcDNAライブラリースクリーニングにより多数の新規遺伝子を入手することができた。これらのうち、6つの遺伝子断片に注目し、完全長cDNAの決定と機能解析を実施し細胞レベルの放射線感受性を規定する、細胞周期あるいは細胞の分化に関連した新規ヒトゲノム4つの全長クローニングに成功し、その機能解析結果とともに報告した。
  細胞レベルでの放射線感受性の検討の結果、従来言われていたp53ステータスのみでは差が大きくなく、元の組織型の放射線感受性とは全く相関しないことが確認できた。更に、10種類のヒト悪性腫瘍細胞由来ヌードマウス移植腫瘍組織レベルでの放射線感受性を検討した。腫瘍組織レベルでの放射線感受性を規定する因子を検討し、酸素電極を用いた研究によって上記10種類の移植腫瘍において、酸素分圧と放射線感受性との相関を立証することができた。更に分子レベルでの検討から、血管新生因子、凝固線溶系因子の細胞レベルでの発現よりもむしろ組織レベルでの発現が重要との結論に達した。
  即ち、in vitroとin vivoの放射線感受性は、細胞レベルでは細胞周期制御やDNA修復に関連したp53など複数の因子によって、組織レベルでは血管新生因子、凝固線溶系因子によって規定される酸素分圧によってというように、それぞれ全く違った機序で規定されている可能性が示唆された。, kaken

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• 特定領域研究(A), 1999年 - 1999年, 06283203, 癌遺伝子産物の生理機能に基づく発癌機構の解析, 山本 雅; 藤元 次郎; 梅森 久視; 松田 覚; 椎尾 譲, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 150000000, 150000000, チロシンりん酸化をはじめとする蛋白質りん酸化反応に着目して、細胞の増殖制御に関する解析を進め、以下の知見を得た。
  1.ショウジョウバエがん抑制遺伝子のヒトホモローグLATS2の産物が、細胞周期のG2/M期でキナーゼ活性が高いことを示し、細胞周期制御に関わっている可能性を示唆した。
  2.細胞増殖抑制性蛋白質TobはPDGF刺激により、Ras,MAPK経路を介してりん酸化され、そのことで増殖抑制活性が調節される。従ってTobは細胞周期のG0あるいはearly G1で機能していると考えられた。
  3.TobはBMP2シグナル伝達に関わり、Tob欠損骨芽細胞ではBMP2反応性が亢進している。その結果、Tob欠損マウスは骨の過形成を示す。
  4.Tob2をβ-galに置換したTob2欠損マウスを作成した。Tob2は種々の組織で普遍的に発現するものの、特に小腸細胞、生殖組織で顕著に発現している。
  5.B細胞で抗原刺激依存的にLynでりん酸化されるCblは、BLNKとPLCγの会合を阻害し、結果としてPLCγの活性を負に制御している。一方Cbl類似Cbl-b蛋白質はPLCγの活性を正に制御している。
  6.Cblに類似するCbl-cを新規にクローニングした。Cbl-cは他のCblファミリーメンバー同様受容体型チロシンキナーゼやSrcファミリーチロシンキナーゼと会合する。
  7.ショウジョウバエFakの発現様式の解析から、Fakがインテグリンシグナル伝達系に関わる事を示唆した。, kaken

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• 基盤研究(C), 1998年 - 1999年, 10670137, 細胞間接着を制御するc-Srcキナーゼ依存シグナル伝達系の解析, 浜口 道成; 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 名古屋大学, 3300000, 3300000, 本研究の主眼点は、シグナル伝達系によるカドヘリン依存症細胞間接着の可逆的な制御機構を生化学的に解明する事にある。我々は、Srcキナーゼのシグナル伝達系を解析し、この細胞間接着系がリン酸化を介するシグナル伝達系によって可逆的な制御を受けることを初めて明らかにした。これらの成果にもとづき本研究は、細胞周期依存の接着制御や、NO依存シグナル伝達系を主題として、細胞間接着系のSrcキナーゼ依存シグナル伝達系による制御機構を解析することを立案した。本年の成果は、(1)Srcキナーゼと結合し、その活性化を促進するアダプター型シグナル伝達因子Crkが、Ras-Mek系を介してカドヘリン依存症細胞間接着を著明に抑制する事を明らかにした。(2)我々は、重金属やNOなどの刺激がc-Srcキナーゼを活性化させる事を初めて明らかにした、そこで、Src導入細胞にeNOS遺伝子を導入し、相互反応を調べたところ、活性型SrcキナーゼとeNosが結合する事を見い出した。以上の成果は、Srcシグナル伝達系による可逆的な細胞接着制御機構を系統的・包括的理解する上で重要な知見となると確信している。, kaken

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• 基盤研究(B), 1998年 - 1999年, 10044261, 細胞周期・増殖を制御するシグナル伝達系の研究, 浜口 道成; 松田 覚; 花房 秀三郎; MAYER Bruce; PELLMAN Davi; DUTTA Anyndi, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 名古屋大学, 3900000, 3900000, 本研究は、第一級の国際的な研究者による共同研究のもとに、細胞周期を統御する細胞内シグナル伝達系を、多様な変異遺伝子を用いて解析する事を目的とする。近年の研究から、細胞の増殖は、チロシンリン酸化を介するシグナル伝達系による正の制御と細胞周期制御因子による負の制御からなるシステムよる統御をいけている事が明らかになっている。そこで、本年は、チロシンフォスファターゼSHP-2の結合蛋白質として同定され、まだ十分その機能が明らかになっていないSHPS-1について解析をすすめた。その結果、v-Srcによる癌化は、SHPS-1の発現を抑制する事、SHPS-1の遺伝子をクローニングし、v-Src癌化細胞にに導入する都、癌細胞の増殖を選択的に阻害する事が明らかになった。, kaken

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• 特定領域研究(A), 1998年 - 1998年, 10169228, チロシンキナーセを標的とした生体機能制御, 浜口 道成; 岩田 啓之; 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 名古屋大学, 1600000, 1600000, 我々は、受容体型チロシンキナーゼTrk、非受容体型チロシンキナーゼSrcを題材として、新規のキナーゼ活性の制御機構を世界に先駆けて発見すると共に、そのシグナル伝達系について系統的な研究を展開してきた。本研究は、TrkキナーゼとSrcキナーゼを標的に、われわれの見い出したキナーゼ活性制御機構の詳細を明らかにし、新しい概念の機能探索子による腫瘍の分化誘導療法、遺伝子療法の開発を目指すものである。本年度は、レドックス依存の新規のSrc活性化機構に焦点を絞り実験を進めた。我々は、Srcキナーゼがシステイン残基に依存して、塩化第二水銀やNOによる酸化還元反応によってキナーゼの括性化を受ける事を見い出した。そこでSrcキナーセのシステイン残基を点突然変異させ、キナーゼ活性や細胞癌化能に対する影響を調べた。v-Srcキナーゼの場合、全長526アミノ酸残基中に10個のシステイン残基を含む。本年は、これらすべてのシステインをアラニンに点突然変異た。その結果、8、9番に突然変異を導入したものは癌化能が温度感受性となり、Src蛋白質の崩壊が起きることが示唆された。この結果は、キナーゼ活性ドメイン中のシステイン残基が、Srcキナーゼの安定性に重要であることを示唆する。そこで、これらの変異型Srcキナーゼの、塩化第二水銀、NO等に対する反応にって解析する予定である。, kaken

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• 重点領域研究, 1996年 - 1996年, 08264107, 転写制御遺伝子群の発癌への関与, 林 健志; 中別府 雄作; 松田 覚; 森下 和弘; 濱田 文彦; 恒吉 正澄, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 九州大学, 13900000, 13900000, 1.hMTH1は、8-oxo-GTP分解酵素であり、突然変異頻度を抑制している。同酵素の遺伝子構造を決定し、択一的スプライシング機構によって数種類の酵素蛋白質が作られること、また、肺癌患者に、スプライシング異常を引き起こす生殖細胞突然変異を見い出した。2.がん抑制遺伝子であるWT1を、トランスフェクション後に強制的に発現誘導させたところ、細胞種によってその帰結が多様であることを見い出した。3.がん遺伝子c-erbB-2の発現調節に関与する転写因子様の蛋白質のcDNA2個を得た。このうちの一個、Kidは、セントロメア領域DNAとも結合し、染色体分配に深く関与していることを明らかにした。今一つのcDNA、tobは細胞増殖を抑制し、細胞周期にも関与することを示した。4.白血病原因遺伝子EVI-1のコードする蛋白質EVI-1のDrosophilahomologueを同定し、その機能を検索したところ、同蛋白質は神経系ニューロン形成の初期過程に関係していることが支唆された。5.平滑筋肉腫組織のp53遺伝子DNAを増幅し、変異配列を検索し、予後因子としての可能性を見い出した。尿路腫瘍の同時性および異時性多発例についての同様の解析では、多発例間で変異が一致するものとしないものがあり、多発性の原因には、モノクローナル、ポリクローナル2種のものがあると結論された。6.高分解能・高度自動化キャピラリー電気泳動装置による効率の良い蛍光PCR-SSCP法を確立した。この方法は、変異の判定を、コンピュータにより統計的根拠によって行うものであり、全過程における人的ミスの排除、検出感度の飛躍的向上を達成した。7.多剤耐性遺伝子の転写因子YB-1のc-DNAおよびゲノムDNAのクローニングを行い、シスプラチン耐性細胞におけるはYB-1の高発現、発現抑制によるシスプラチン感受性の増加を証明した。, kaken

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• 重点領域研究, 1995年 - 1995年, 07272108, 転写制御遺伝子群の発癌への関与, 林 健志; 中別府 雄作; 松田 覚; 森下 和弘; 濱田 文彦; 常吉 正澄, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 九州大学, 14700000, 14700000, 発癌に関与する転写遺伝子群の作用機構に関わる数多くの遺伝子群を同定した。またこれらの遺伝子群の臨床的な癌における構造異常検索を行い、かつより多くの遺伝子構造異常検索のための実験系の確立に着実な成果をあげた。浜田は、転写関連の遺伝子で、かつがん抑制遺伝子であるWT1と相互作用する蛋白質のcDNAを酵母two hybrid法を用いて単離し、その性質を明らかにし、またWT1の白血病細胞増殖抑制作用を見いだした。中別府は、核内がん遺伝子産物△FosBがmRNAの安定化という新しいメカニズムによってサイクリンEとそのパートナーであるCDK2の発現を増加させ、細胞周期の回転、すなわち細胞増殖を引き起こし、これが細胞癌化を引き起こしうることを見いだした。松田は、がん遺伝子c-erbB-2の発現調節に関与すると思われる転写因子様の蛋白質のcDNA2個をサウスウェスタン法によってクローニングした。このうちの一個(toblと命名した)は細胞増殖抑制遺伝子btglと相同性を示すものであった。これ自身、細胞の増殖を抑制したが、この阻害は細胞周期依存的であり、CDK4等との相互作用によることを見い出した。森下は白血病原因遺伝子EVI-1の持つ2個のDNA結合領域はGATA/ETS結合領域と類似しており、これらの転写因子と相互作用することにより癌化を引き起こすと結論した。恒吉はホルマリン固定パラフィン包埋標本から効率よく標的DNAを増幅し、変異配列を検索する実験法を確立し、これを利用して平滑筋肉腫、大腸癌各数十例でのp53の異常を検索した。またこの結果と臨床病理学的データ、およびp53蛋白質の免疫染色の結果を総合し、診断への応用について検討した。林は遺伝子構造異常の大規模検索法として、PCRチューブ内での極めて単純な操作のみで行える増幅産物のポストPCR蛍光標識法を開発し、さらにキャピラリー電気泳動式DNAシークエンサーを用いた高度に自動化された非RIのPCR-SSCP法を確立した。さらに白血病細胞におけるp53遺伝子の突然変異検出に極めて有効であることを示し、今後臨床診断としてのDNA診断の実現にとって極めて重要な技術革新である。, kaken

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• 国際学術研究, 1994年 - 1995年, 06044068, 細胞膜上受容体から核内転写因子に至るシグナル伝達に関する共同研究, 井上 純一郎; VERMA Inder; 大塚 雅巳; 梅森 久視; 松田 覚; 山本 雅; 山梨 裕司, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 7000000, 7000000, 本研究は細胞膜から核に至るシグナル伝達の経路として初年度はTNFα受容体による経路について解析を進めていたが、最終年度(次年度)では、CD40による経路についても研究の対象のすることにした。これは初年度に下記のようにCD40からのシグナルについて多くの知見を得たことによる。
  1.TNFα受容体或いはCD40からRel/IkB複合体へ至るシグナルの解析:B細胞の受容体であるCD40は、活性化T細胞に存在するCD40リガンド(CD40L)と結合することによりB細胞内にシグナルを伝達する。ヒトにおいてCD40やCD40Lの点突然変異により重度の免疫不全hyper IgM immuno deficiency (HIM)が発症することから、CD40シグナルを解明することは、免疫病の原因解明という点で重要である。現在までの報告から、CD40シグナルは、B細胞における抗体のクラススイッチ、アポトーシスの抑制、また増殖促進に必須であると考えられる。本研究では、自己免疫疾患の発症に深く係わるB細胞の選択的増殖において重要と考えられる、B細胞アポトーシスの制御機構を中心にCD40シグナルを研究し、以下の事実を明かにした。(1)抗原受容体からのシグナルによって誘起される細胞死のシグナルによりBcl-X_L及びCDK4&6の発現量が著しく減少するが、CD40からのシグナルはこの減少を抑制し、各々の発現量を正常のレベルあるいはそれ以上に戻す。(2)抗原受容体からのシグナルによって誘起される細胞死は、Gl期停止の後に起こる。Bcl-X_L恒常発現株は抗原受容体からのシグナルによりGl期停止を起こすが細胞死に至らない。ただしS期に移行することが出来ない。(3)CD40からのシグナルにより転写因子Relは活性化される。(4)CD40の細胞質領域の欠損変異体を調整し解析したところ細胞死抑制とBcl-xLの発現誘導に必要な領域は一致したが、Rel活性化についてはより狭い領域で十分であった。(1)と(2)よりCD40によるアポトーシスの解除及び細胞増殖には少なくともCD40からの二種類のシグナルが必要であるとするtwo signalsモデルが考えられる。一つはGl期に停止した細胞の死を抑制する“Bcl-X_Lの発現誘導"。いま一つは、細胞周期をまわしてS期に入るための“Cdk4&6"の発現維持である。Rel活性化の細胞死抑制における役割はまだ明らかでない。
  2.新規シグナル伝達因子の同定:酵母を用いたツ-ハイブリッドcDNAクローニングシステムを用いてCD40の細胞質領域に結合しシグナルを伝達する因子を探索した。その結果、少なくとも二種の新しい蛋白質をコードするcDNAを得た。現在、全コード領域を含むcDNAのクローニングを進行させている。また、二種の蛋白質の一部分を恒常的に発現する細胞を調整し、その発現によりCD40のシグナルがdominant negativeに抑制されるかどうか検討中である。
  3.転写因子Relの活性化機構:Rel蛋白質の活性化には制御因子IkB蛋白質のシグナルに依存した急速な分解による不活化が必要である。TNF受容体由来シグナルの最終段階であるIkBの分解を分子レベルで解明するため、IkB中に存在する分解に必須な領域を同定した。その結果、IkBのC末端側に存在するPEST配列は分解に必要でなく、分子中央に存在するアンキリンリピート構造を欠失させると外来シグナル存在下でも安定であることが明らかとなった。また、刺激依存性のIkBのリン酸化にはアンキリンリピートもそのC末端側も必要ないことが明らかとなった。
  4.IkB kinaseの解析:細胞破壊液中にIkBのN末端側に結合しかつリン酸化する蛋白質を同定した。現在、その蛋白質の精製を進行させている。
  5.転写因子Relの活性を抑制する薬剤の開発:Rel蛋白質のDNA結合活性を抑制する新規複素環化合物を合成した。数種の誘導体を合成し、Relの他に同じDNA配列を認識するHIV-EP1に対する抑制活性を解析したところ、両者のどちらか一方のみを抑制する化合物を同定した。今後、これらの化合物を両転写因子がその複製に重要と考えられているHIV感染細胞に作用させその効果を見るつもりである。, kaken

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• 重点領域研究, 1994年 - 1994年, 06280115, 転写制御遺伝子群の発癌への関与, 林 健志; 恒吉 正澄; 森下 和弘; 松田 覚; 佐藤 明; 中別府 雄作, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 九州大学, 13500000, 13500000, 各班員はそれぞれの実験系を用いて、発癌に関与する転写遺伝子群の作用機構を解明し、これに関わる他の遺伝子群を数多く同定した。またこれらの遺伝子群の癌化における構造異常検索のための実験系の確立に着実な成果をあげた。即ち、中別府は、核内がん遺伝子fosBの産物の一つである△FosBがサイクリンEとそのパートナーであるCDK2の発現をmRNA安定化によって増加させ、細胞増殖を引き起こすことを見いだした。佐藤は、がん抑制遺伝子WT1が細胞のG1/S移行を阻害し、またEC細胞の分化に抑制的に働き、血球系幹細胞と急性白血病細胞で異常発現していることを見いだした。松田はがん遺伝子c-erbB-2の発現調節に関与すると思われる転写因子様の蛋白質のcDNA2個をサウスウェスタン法によってクローニングした。一個はZink fingerを15個含む転写因子様蛋白質をコードし、今一個は細胞増殖抑制遺伝子btg1と相同性を示し、核移行シグナルと、PQの繰り返しを含むもので、これ自身、導入細胞の増殖を抑制した。森下は白血病原因遺伝子EVI-1の持つ2個のDNA結合領域の結合配列特異性を詳細に検討し、転写の活性化と抑制の両側面にそれぞれ関与していることを明らかにした。さらにこの蛋白質によって発現制御を受ける遺伝子の同定を進めている。恒吉は軟部悪性腫瘍(肉腫)における遺伝子構造異常を検索するためにホルマリン固定パラフィン包埋標本からの標的DNAの効率よいPCR増幅条件の検討を行ない、PCR-SSCP法によってすでに2例のp53点突然変異を同定している。またこれらの異常と、病理学的知見との相関に関して多くの知見を得ている。林は遺伝子構造異常の大規模検索法として、ポストラベル法による蛍光標識PCR-SSCP法の開発を行い、従来法の欠点であった蛍光標識プライマーの合成を経由しない実験法を確立した。, kaken

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• 重点領域研究, 1993年 - 1993年, 04253203, がん遺伝子の機能解析, 山本 雅; 梅森 久視; 松田 覚, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 42000000, 42000000, 我々は、チロシンキナーゼの生理機能を明らかにすることが細胞がん化の機構を解明する上で重要であると考えて以下の研究を行なった。
  1.lyn遺伝子を欠損する細胞株等に遺伝子を導入する実験から、Bリンパ球の抗原受容体と会合するLynキナーゼがSykキナーゼと共存することにより、細胞内蛋白質のチロシンリン酸化反応を促進することを示した。又fynを過剰発現するT細胞ハイブリドーマでは、Fynの活性化がZAP-70キナーゼの活性制御に関わっていることを示唆する結果を得た。一方、CD30陽性リンパ腫でチロシンリン酸化が亢進しているp80蛋白質を同定し、その分子生物学的解析を進めると共に、リンパ腫発症に於けるp80の意義を検討している。
  2.脳で発現する新規チロシンキナーゼ遺伝子fakとbrtのcDNAをクローニングした。fakは同時期に外国のグループによって細胞接着に関わることが示されたが、我々はfakの脳特異的産物を見いだしており、fak欠損マウスの作成や、免疫生化学的手法を用いてその機能解析を進めている。又Fynがミエリン形成に関わることを示し、更にfyn欠損マウスでミエリン形成が不完全であることを示した。
  3.受容体型チロシンキナーゼErbB-2の標的蛋白質としてTob-1ならびにTob-2を同定し、そのcDNAクローニングを行なった。tob-1遺伝子はヒト染色体17q22にマップされること、そしてTob-1蛋白質が細胞増殖抑制活性を有することを示した。又、エストロゲンがErbB-2チロシンキナーゼ活性を促進するという昨年度の成果に基づいて、エストロゲンに抗がん剤を結合させ、ErbB-2過剰発現細胞を選択的に殺傷することに成功した。, kaken

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• がん特別研究, 1991年 - 1993年, 05151042, 細胞がん化における蛋白質リン酸化, 秋山 徹; 入江 賢児; 西田 栄介; 月田 早智子; 松田 覚; 野島 博, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 大阪大学, 24000000, 24000000, 1)MAPキナーゼキナーゼ(MAPKK)が、MAPKK-Kによってリン酸化されて活性化すること、MAPキナーゼによってもリン酸化されることを明らかにした。MAPKKに対する中和抗体を用いてMAPキナーゼの活性化が卵成熟過程におけるMPFの活性化に重要な役割を担っていることを示した。2)酵母のシグナル伝達系においてプロテインキナーゼCの下流で機能する因子を同定しBck1-Mkk1/Mkk2-Mpk1の順序で機能することを明らかにした。これはそれぞれ動物細胞におけるMAPKK-K,MAPKK,MAPキナーゼと対応する。3)各種インスリン受容体の解析より、IRS-1チロシンリン酸化とRas活性化、細胞増殖作用とが並行することを見いだした。IRS-1欠損マウスの作製に成功し、prenatalおよびpostnatalの個体の発育の傷害を認めた。4)CskがFynやLckからの細胞内情報伝達を抑制することを明らかにした。5)ErbB-2にエストロジェンが作用してそのキナーゼ活性を上昇させることを明らかにした。6)好中球においてFgrがIgGFc受容体IIと複合体を形成し、IgGFc受容体IIを介したシグナル伝達路上に存在すると考えられた。7)CotはC末端部分の欠失によりキナーゼ活性が亢進して細胞トランスフォーミング能を獲得したことを明らかにした。8)CrkのSH3領域に結合する蛋白質としてRasグアニンヌクレオチド交換因子C3GのcDNAをクローニングした。9)アンチセンスDNAを用いてERMファミリーが細胞間と細胞基質間の接着および微絨毛の形成に重要な役割をしていることを明らかにした。ERMがCD44に結合していることを見いだした。, kaken

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• がん特別研究, 1991年 - 1993年, 04151039, 細胞癌における蛋白質リン酸化, 秋山 徹; 野島 博; 月田 早智子; 高橋 雅英; 松田 覚; 西田 栄介, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 大阪大学, 24000000, 24000000, 1)MAPキナーゼキナーゼの精製・cDNAクローニングに成功し、MAPキナーゼキナーゼ/MAPキナーゼカスケードが酵母からヒトまで保存されたシグナル伝達システムであることを明らかにした。さらにMAPキナーゼキナーゼが存在することを示した。また、ras p21の下流でMAPキナーゼキナーゼ/MAPキナーゼが活性化することを示した。2)β-カテニンがチロシンキナーゼの基質となり、この蛋白質がリン酸化されると細胞接着能が低下することを見出した。また、スキラスタイプの胃癌では、高率(2/3以上)でαカテニンの発現が見られないことを明らかにした。3)Src型チロシンキナーゼFynからの情報がT細胞においてIL-2プロモーター及びc-fosプロモーターを活性化することを明かにした。この情報伝達にFyn蛋白質構造の中のSH2領域が重要であること、CSKの存在により活性が負に調節されていることを明らかにした。4)ヒトCRK遺伝子のクローニングを行ない、そのmRNAが2種類あること、その産物はp28CRK-Iとp40/p42CRK-IIであることを明らかにした。CRK遺伝子産物をmicroinjectするとPC12細胞の分化を誘導することが明らかになった。5)癌抑制遺伝子Rbの産物(RB蛋白質)のリン酸化に細胞周期のG1→Sの移行を制御するキナーゼcdk2が関与していることが示唆された。6)分裂酵母の温度感受性細胞周期変異株のうちcdc2.cdc10.cdc13を宿主とした用い、それらの変異を機能相補するcDNAを多数単離した。各々の変異遺伝子のホモログ以外にResl.Resl/Cdc10.Reml.RNA結合蛋白質などが単離された。7)膀胱癌の予後因子の多変量解析の結果、ErbB2過剰発現は独立した重要な予後因子であることが判明した。, kaken

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