共同研究・競争的資金等の研究課題

• 基盤研究(C), 2022年04月 - 2025年03月, 22K04842, 細胞壁自己消化性酵母を用いたスクアレン回収システムの構築, 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 奈良女子大学, 4290000, 3300000, 990000, kaken

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• 挑戦的萌芽研究, 2012年04月01日 - 2014年03月31日, 24658289, バイオ燃料実用化に向けた炭化水素分泌酵母の作製, 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3380000, 2600000, 780000, 緑藻Botryococcus braunii（ボトリオコッカス）はボトリオコッセンとよばれるオイルの一種を細胞外に分泌するというきわめてユニークな性質をもつ。このボトリオコッセンはバイオ燃料としての活用が期待されている。
  しかし、ボトリオコッカスは成長も遅く、さらに多くのボトリオコッセンを生産するような改変をするための技術も開発されていないという欠点がある。
  そこで本研究では、遺伝子工学的な改変が容易な出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeに、ボトリオコッセン合成に関係する遺伝子を組み込み、ボトリオコッセンを合成させるように改良した。, kaken

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• 萌芽研究, 2003年 - 2004年, 15657016, 海洋微生物ラビリンチュラのドコサヘキサエン酸生成に関する細胞学的解析, 野口 哲子; 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3200000, 3200000, ラビリンチュラ類は卵菌と不等毛植物の特徴を持つ汽水域に生息する単細胞生物である。Schizochytrium limacinum 21株(SR21株)は多量の脂肪酸を細胞内に蓄積し、なかでも高度不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)を多量に生成する微生物として、近年注目されている。本研究では、SR21株のDHA生成を細胞学的に解析した。まず、SR21株の同調培養系を確立し、100%の遊走子群を得た。この系を用い、遊走子及び遊走子着床後4、8、12、24時間、10日目の栄養細胞で、オイルボディーの形成過程を形態学的に観察し、それに伴う脂質量、及び脂肪酸組成の変化を解析した。
  Nile red染色によって生活史の全ての時期にオイルドロップが観察されたが、オイルドロップは遊走子着床後の細胞成長に伴って大きくなり、細胞当たりの数も増加した。電子顕微鏡観察では、パルミチン酸を1、3位に、DHAを2位に持つトリアシルグリセロール(TG)の結晶様構造による縞模様を呈するオイルボディーが観察された。このタイプのオイルボディーは遊走子では余り観察されず、成長中の細胞で出現し、12時間目で細胞質の1/2以上を占めた。成長中の細胞では、小さなオイルボディーが小胞体に接し、小胞体内には観察されないため、オイルボディーは小胞体上で合成されると考えられた。
  細胞生長に伴い細胞当たりの脂質量も増加したが、総脂肪酸中のDHAの比率は24時間目以降低下した。そこで脂質を、主にオイルボディーの構成成分であるTGと生体膜成分であるホスファチジルコリン(PC)に分画し、それぞれの脂肪酸組成を解析した。その結果、遊走子及び着床後24時間目の細胞では、PCにおけるDHAの脂肪酸組成がおよそ60%であったのに対し、10日後には10%以下に低下した。一方、TGではDHAの脂肪酸組成に大きな変動は認められなかった。, kaken

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• 基盤研究(C), 2001年 - 2002年, 13640665, 緑藻Botryococcus brauniiの炭化水素生成機構の細胞学的研究, 野口 哲子; 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3400000, 3400000, 単細胞緑藻Botryococcus brauniiは、細胞乾燥重量の30〜60%もの多量の炭化水素を生成・分泌する。炭化水素生成過程の細胞微細構造の解析と平行して生化学的な解析を進める目的で、B.brauniiでは通常細胞質分裂直後に起こる炭化水素生成を、間期の細胞に誘導する系を確立した。間期の細胞外に蓄積した炭化水素を流動パラフィンにトラップさせて除去しても、顕著な炭化水素生成を誘導できなかった。間期の細胞を細胞壁分解酵素で適度なスフェロプラストにした場合、処理前に比べて約3倍量の炭化水素生成を誘導できた。更に、スフェロプラストの炭化水素生成量は分解酵素の除去後に時間と共に増加し、5時間後に最大量(12倍)になり、その後減少することが判った。炭化水素生成を最大限誘導したスフェロプラストの微細構造を電子顕微鏡で解析した。その結果、スフェロプラストの周囲に多量の炭化水素が蓄積していることを確認した。更に、ゴルジ体とトランス-ゴルジ-ネットワーク(TGN)は、通常の細胞周期で炭化水素を活発に生成するセプタム形成直後のゴルジ体やTGNに形態的に類似し、これらのオルガネラが炭化水素生成に関与することが強く示唆された。ゴルジ体・TGNを中心とした小胞輸送に関与するCOP被覆小胞のB.brauniiのβ-COP相同遺伝子をクローニングし(3,313塩基配列)、β-COPに対するポリクローナル抗体を作製して、免疫電子顕微鏡法でB.brauniiにおけるβ-COPの局在を明らかにした。確立した炭化水素誘導系を利用し、B.brauniiの炭化水素前駆体である脂肪酸伸張酵素に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングでは、約54kDaのタンパク質を検出した。スフェロプラスト作製のために、B.brauniiの細胞壁構成物質組成と単糖組成を解析した結果、本藻特有のものであることも明らかにできた。, kaken

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• 奨励研究(A), 2000年 - 2001年, 12780474, 酵母のイノシトールリン脂質の低温耐性および細胞内膜小胞輸送における役割の解明, 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 2400000, 2400000, 酵母(Saccharomyces cerevisiae)のSCS2遺伝子産物は、細胞内膜小胞輸送に関与する膜蛋白質であるシナプトブレビンに結合する蛋白質としてラットやマウスなどで発見されたVAP-33と相同性がある。一方、この遺伝子を破壊した酵母はイノシトール要求性や低温耐性を示す。これらの表現型と他の遺伝子との遺伝学的相互作用の結果から、SCS2遺伝子破壊株ではイノシトールリン脂質の代謝に異常があり、それが結果として低温耐性を引き起こすと考え、この関係の分子的要因を明らかにするためにSCS2遺伝子産物の機能解明を試みた。
  本研究ではまずSCS2破壊株のイノシトール要求性を与える要因を明らかにしようとし、SCS2破壊株では酵母のイノシトール生合成に必須の遺伝子であるINO1遺伝子の発現量が野性株に比べて明らかに低下していたこと、しかし、外来プラスミドに挿入したINO1プロモーターからの遺伝子発現はほぼ正常であったことを明らかにした。このことから、SCS2遺伝子産物は染色体に働きかけてINO1プロモーターからの遺伝子発現を正に調節するタンパク質であることが示唆された。一方、SCS2遺伝子破壊株のイノシトール要求性は、ホスファチジルコリン生合成のためのCDPコリン経路に位置する遺伝子を破壊すると回復するが、もうひとつのPC生合成経路であるPEメチル化経路を破壊しても回復しないことを明らかにした。
  また、SCS2破壊株のリン脂質と中性脂質組成を調べたところ、この破壊株には他のリン脂質代謝変異株に見られたような野性株との大きな相違は観察されなかった。ただし、34℃で生育させたときにイノシトールの代謝が盛んになることを明らかにしたことから、SCS2岐壊株でみられた高温感受性のイノシトール要求性は高温でのイノシトール代謝昂進にイノシトール生合成が追いつかなくなったためと推測された。, kaken

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• 基盤研究(C), 1999年 - 2000年, 11640664, 緑藻Botryococcus brauniiの炭化水素生成に関する細胞学的研究, 野口 哲子; 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3000000, 3000000, 単細胞緑藻Botryococcus brauniiは、乾燥重量の30〜60%もの多量の炭化水素を細胞壁表面に分泌する。この炭化水素生成機構を細胞学的観点から解析した。ガスクロマトグラフィーで解析した結果、本実験に用いたB.brauniiの生成する炭化水素は、炭素数29または31で、二重結合を二個有する直鎖不飽和型であった。アミノウラシルを用いてB.brauniiを同調培養し、^<14>C-酢酸を用いたオートラジオグラフィー法で解析した結果、炭化水素生成は細胞分裂直後に起こることが判った。電子顕微鏡の急速凍結置換法で細胞周期を通したゴルジ体とtrans-Gologi-networkの構造変化を調べた結果、炭化水素生成は細胞分裂後のプロトプラスト表面で細胞壁形成に先だって起ること、この時期にはtrans-Golgi-networkが発達し、大型の小胞を特異的に形成することが明らかになった。^<14>C-酢酸を用いた電子顕微鏡オートラジオグラフィーでも、炭化水素の前駆体がtrans-Golgi-networkを経由して細胞表面に運ばれる可能性を示唆できた。そこで、炭化水素前駆体の細胞内輸送経路を実証する目的で、炭化水素のポリクロナール抗体の作製を試みたが、現段階では成功していない。炭化水素をバクテリアにコートして免疫するなど、今後も工夫を続ける。炭化水素生成の生化学的な解析には、高率に同調した細胞質分裂直後の細胞群が必要であった。しかし、B.brauniiの同調培養は経験と技術を要し、容易でなかったため、interphaseの細胞に炭化水素生成を誘導する系の開発を始めた。現時点で、interphaseの細胞をスフェロプラスト処理し、処理前に比べて10〜15倍量の炭化水素生成を比較的容易に誘導できるようになった。, kaken

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• 生体膜の構造と機能に関する分子生物学的研究, 0, 0, 0, 競争的資金
• Structure and function of biomembrane, 0, 0, 0, 競争的資金