Research Projects

• Grant-in-Aid for Scientific Research (C), 01 Apr. 2012 - 31 Mar. 2015, 24570049, Effects of mechanical-stress induced changes in plant body size on photosynthetic function: mechanisms and biological significance, SAKAI Atsushi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nara Women's University, 4160000, 3200000, 960000, Plants change their body sizes in response to mechanical stress (MS) such as trampling. During the process of decrease/increase of plant body size in response to the application/elimination of MS, nitrogen within the plant body might be concentrated/diluted accordingly, which, in turn, result in lower/higher photosynthetic potentials. Such a “chain reaction” appeared to be more popular among perennial clonal plants and relatively rare among plants with high MS sensitivity.
  Under MS, photosynthetic production of a plant/stand as a whole declines as a result of miniaturization. However, increase in photosynthetic potential per area resulting from nitrogen enrichment should partly compensate for the reductions in the total photosynthetic productivity. Moreover, the MS-induced miniaturization was found to increase survivability of plants dramatically under certain circumstances., kaken

  対象リソースIRI
• Grant-in-Aid for Scientific Research (C), 2009 - 2011, 21610013, Research of the Environmental Design and the Educational Meaning on the Play Area and Garden in the Kindergarten, HAMADA Sumio; MUTO Takashi; SETO Akiko; NISHIMURA Takuo; MOTOYAMA Masako; AMAGASE Masahiro; SUZUKI Koshi; ASAO Takeshi; SAKAI Atsushi; HORIKOSHI Norika; HIGASHIMURA Tomoko, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nara Women's University, 4680000, 3600000, 1080000, The play area and garden in the kindergarten has functions as educational facilities and as social capitals. In this research, we investigated and inquiried the history of the kindergarten and play area, the feature of the gardening design in the present, and the using for children's plays and activities, and we clarified the environmental design and the educational meaning of the play area and garden, kaken

  対象リソースIRI
• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 2006 - 2008, 18380090, Effects of deer browsing and debarking on life history and population dynamics of insects through the changes of morphology and quality of host plants, SHIBATA Eiichi; SATO Hiroaki; SAKAI Atsushi; HINO Teruaki, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nagoya University, 17640000, 15000000, 2640000, ニホンジカによる樹木剥皮と林床植生の採食が激しい大台ヶ原と奈良公園において、シカをめぐる生物間相互作用を明らかにした。大台ヶ原では、シカの採食はササの小型化をもたらすが、それは接触刺激によることが示唆された。またゴールを形成するタマバエの間接効果を明らかにした。奈良公園では、防御形質と考えられるイラクサ刺毛密度の進化にシカの被食が淘汰圧として作用していることが示唆された。, kaken

  対象リソースIRI
• Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas, 2004 - 2008, 16085208, Analysis on multiplication of plastids and organelle gene expression in plant function, TAKANO Hiroyoshi; TAKIO Susumu; SAKAI Atsushi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Kumamoto University, 65000000, 65000000, 植物の高次機能とオルガネラとの関係を探るため、色素体分裂機構とオルガネラDNA複製機構の研究を行った。色素体の分裂機構に関しては、コケ植物でペプチドグリカン(PG)合成系が葉緑体の分裂に関与することを明らかにした。一方種子植物では、PG系の遺伝子が色素体遺伝子発現に関与していた。オルガネラDNA複製機構については、タバコより単離したDNA合成酵素がミトコンドリアと色素体の両オルガネラDNAを複製する主たる酵素であることを見いだした。, kaken

  対象リソースIRI
• 萌芽研究, 2005 - 2006, 17657019, 大型植食動物による被食圧に対する植物の反応, 酒井 敦; 佐藤 宏明; 柴田 叡弌, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3500000, 3500000, 本研究では、大台ケ原山においてニホンジカによる被食圧下で分布を拡大しつつあるミヤコザサを材料に、植物の耐被食戦略を検討した。前年度までの研究により、「シカによる被食圧下にあるササは接触刺激を認識して小型化し、その結果植物体各部の窒素濃度の増大・光合成装置の増加により光合成能力が向上し、その結果として小型化(=受光面積の縮小)に伴う光合成物質生産の低下が補償される」、という可能性が示唆された。18年度はこの「接触形態形成に端を発する連鎖反応による補償光合成」の可能性をさらに検討した。
  1.小型化の意義:シカによる被食圧下にあるササ群落内に、プロテクトケージを用いて様々な高さのササのパッチを作製した後ケージを撤去し、シカの食害による葉の損失速度を測定した。その結果、周囲よりわずかに背が高くなると葉の損失が急増することから、小型化は集中的な食害の回避に必須であることが分かった。
  2.稈密度:大台ケ原山正木峠周辺のササ群落の当年稈密度は、防鹿柵外で約3000本/m^2、防鹿柵内(シカから5年にわたり保護)では約1200本/m^2であった。プロテクトケージを、時期をずらして設置したところ、当年稈の密度は前年の初夏(6月から7月頃)に決定されることが示唆された。柵外における稈密度の増大は、食害回避のための個々の稈の小型化のもとで群落レベルでの物質生産速度を維持することに貢献していると推察される。
  3.シカによる被食圧のかわりに接触刺激のみを与えてササを栽培した場合にも、小型化と光合成能力の増大が誘導された。しかし、窒素含量の増加は認められなかった。この原因としては、生育環境(野外では強光条件下、栽培実験では弱光・貧栄養条件下)、あるいは変化の方向性(野外実験では大型化に伴う変化、栽培実験では小型化に伴う変化)の影響が考えられた。現在、これらの点を検討するための野外実験および栽培実験を開始している。, kaken

  対象リソースIRI
• 基盤研究(C), 2004 - 2004, 16637001, 植物モデル細胞の高度利用と関連情報の統合に関する調査研究, 松岡 健; 長田 敏行; 馳澤 盛一郎; 江坂 宗春; 園部 誠司; 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 独立行政法人理化学研究所, 3100000, 3100000, 本企画調査は、日本で作成され、世界的に最も広く基礎研究に利用されている植物培養細胞株であるBY-2細胞に関する研究知識を統合し、その利用価値を格段に高めることを目的として、そのためにどのような枠組みを作るべきかを調査し、可能であればその枠組みの構築を図ることを目的としている。そのために、BY-2細胞を利用して研究している研究者間の交流と、主要な研究者における枠組みに関する討議が必要となると考えられた。そこでまず、分担者がそれぞれの該当するフィールドで、この細胞を用いて研究を行っている主な研究者をリストアップした。ついで、これらの外国の研究者を交えて、研究交流とこの細胞に関する国際的な研究協力体制構築のための立ち上げを模索するために、国際シンポジウムを開催することとし、本科学研究費の研究グループ、理化学研究所植物科学研究センター、BY-2研究会の3者の共催として、平成16年9月に理化学研究所横浜研究所を会場として国際会議を開催した。この会議には、海外の6カ国からの招待講演者15名を含む32名の口頭発表と、20件のポスター発表が行われ、合計152名が参加した。また、この会議の折に、本研究のメンバーと海外の代表的な研究者5名で、今後の共同研究体制に関する打合せを行った。結果的には、今後の国際共同研究を企画するための情報を交換するためのホームページを代表者が年度内に立ち上げること、そのホームページを利用しながら、国際的な協調体制のための予算申請についての討論を行ってゆくこと、及び情報の蓄積場所と内容についての国際的な分担等を合意した。そこで、この合意を会議の最後のセッションで参加者にアナウンスした。また、このためのホームページを代表者が立ち上げた。, kaken

  対象リソースIRI
• Grant-in-Aid for Scientific Research (C), 2000 - 2002, 12640634, Hormone-induced differentiation of BY-2 cultured tobacco cells ; development of a model system for differentiation of root-cap cells., SAKAI Atsushi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nara Women's University, 4800000, 4800000, In conventional medium containing auxin (2,4-D, 0.2mg1^<-1>), BY-2 cultured tobacco cells proliferate actively, forming simple cell clusters composed of 8 to 16 small cylindrical cells connected in tandem, and the plastids within the cells remain undifferentiated throughout the culture period. By contrast, in a modified medium that contain cytokinin (BA, 1mg1^<-1>) instead of auxin, BY-2 cells become large without active cell proliferation, and the plastids within the cells differentiate into amyloplasts. In addition to these characteristics (inactive cell proliferation, cell enlargement, amyloplast development), we found that the behavior of BY-2 cells in the auxin-depleted medium resembled to that of root-cap cells in that (i) they easily exfoliate with each other, (ii) exhibited short lifetime, and (iii) showed higher secretion activity. Four proteins specifically secreted by root-cap cell-like BY-2 cells were detected, and one of them (named SPCT44) was identified as secreted peroxidase by N-terminal peptide sequencing of the purified protein. For other three proteins, we could not determine N-terminal peptide sequence because N-terminal was blocked. Their identification by determining internal peptide sequence is now on progress. To analyze changes in the gene expression during differentiation of normal BY-2 cells to root-cap like ones, we performed ddRT-PCR and microarray analyses (collaboration with RIKEN), using mRNAs purified from BY-2 cells cultured 12 h in either conventional medium or modified medium, and identified several genes whose expression is activated according to differentiation of root-cap like cells. The results are opened in the BY-2 EST database by RIKEN (http://mrg.psc.riken.go.jp/strc/). I'd like to further analyze the similarity between root-cap cells and the root-cap cell-like BY-2 cells in the modified medium, by using molecular markers obtained through this research project., kaken

  対象リソースIRI
• 特定領域研究(A), 2000 - 2000, 12025220, 光合成機能の獲得に伴う色素体及びミトコンドリアの転写複製活性の変化とその制御, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 2600000, 2600000, トウモロコシは典型的なC_4植物であるが、葉位あるいは葉の発達・老化段階に依ってはC_3的な光合成特性を示すと報告されている。トウモロコシ芽生えの各葉について、クロロフィル含量が最大になる時期のCO_2補償点を測定した結果、第一葉、第二葉、第三葉いずれもC_4植物に特徴的な低い値を示したのに対し、幼葉鞘は極めて高い値を示した。組織切片観察の結果、幼葉鞘にはC_4植物に特徴的なクランツ構造がなく、C_4光合成に必要なC_4型PEPCのmRNA及びタンパク質も検出されなかったことから、幼葉鞘はC_3型の光合成を行っていることが示唆された。次に第一葉の成熟/老化過程における光合成特性の変化を解析し、CO_2補償点は葉の成熟につれ低下し、老化に伴って高くなることを明らかにした。組織切片観察の結果から、維管束鞘細胞よりも葉肉細胞の方が早く葉緑体が退化すること、またwestern解析の結果から、維管束鞘細胞で働くRubiscoよりも葉肉細胞で働くC_4型PEPCの方が早く分解/消失することが示された。これらの結果から、トウモロコシの老化葉がC_3的な光合成特性を示すのは、CO_2を濃縮する役割を果たしている葉肉細胞が維管束鞘細胞よりも早く老化し、機能を失うためと推測された。また、RT-PCRによりパクテリアのDNA polymerase Iとの類似性が認められるアラビドプシス遺伝子の単離を行い、この遺伝子産物が葉緑体へ移行するためのトランジットペプチドをもち、DNA polymerase IのN末端側にあるエキソヌクレアーゼ活性部分のみをコードしていることを明らかにした。, kaken

  対象リソースIRI
• 特定領域研究(A), 1999 - 1999, 11151205, 光合成機能の獲得に伴う色素体およびにミトコンドリアの転写・複製活性の変化とその制御, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3600000, 3600000, 本研究は、単離色素体核・ミトコンドリア核を用いたin vitro転写/DNA合成体を活用し、特にDNAおよびRNAポリメラーゼに注目しつつ、(1)これらオルガネラのDNA複製/転写系が互いにどのような影響を及ぼしつつ進化してきたか、(2)植物細胞の増殖・分化過程(特に光合成機能獲得過程)において両オルガネラの複製/転写機能がどのような機能により統合的に制御されているか解明することを目的とする.今年度の主要成果は以下のとおりである.
  1.対数増殖期のタバコ培養細胞BY-2、根冠型細胞への分化を誘導したBY-2、タバコ植物体の成熟葉から単離した原色素体核、アミロプラスト核、緑葉体核を用いたin virto転写系を用いた解析の結果、光合成型色素体における転写にはtagetitoxin感受性型RNAポリメラーゼが働いているのに対し、非光合成型色素体においてはtagetitoxin非感受性型RNAポリメラーゼが主力となっていることが明らかになった。しかしながら、詳細な解析の結果、幾つかの光合成関連遺伝子(psbA等)やtRNA遺伝子(trnQ,trn fM等)は非光合成型色素体においてもtagetitoxin感受性PNAポリメラーゼにより選択的に転写されていることが明らかになった。
  2.対数増殖期にあるタバコ培養細胞BY-2から単離した原色素体核とミトコンドリア核の2MNaCl抽出液をアフィニティー(heparin)、陽/陰イオン交換、ゲルろ過、ならびに疎水性などの各種クロマトグラフィーにかけ、色素体およびミトコンドリアのDNAポリメラーゼの挙動を調べた結果、いずれの場合も両オルガネラのDNAポリメラーゼはよく似た挙動を示すことを明らかにした。, kaken

  対象リソースIRI
• 奨励研究(A), 1998 - 1999, 10740366, 色素体RNAポリメラーゼの多様性と役割分担に関する生理・生化学的研究, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 2300000, 2300000, 本研究は、単離色素体核を用いたin vitro転写系を活用し、特にRNAポリメラーゼの多様性と役割分担に注目しつつ、植物細胞の増殖・分化過程(特に光合成機能獲得過程)において色素体の転写機能がどのような機構により統合的に制御されているか解明することを目的とする。色素体では、少なくとも2種類(大腸菌型とT7ファージ型)のRNAポリメラーゼが働いていることが明らかになっており、大腸菌型は転写阻害剤tagetitoxinに対し感受性、T7ファージ型はtagetitoxin非感受性と推測される。対数増殖期のタバコ培養細胞BY-2、根冠型細胞への分化を誘導したBY-2、タバコ植物体の成熟葉から、それぞれ原色素体核、アミロプラスト核、葉緑体核を単離し、それら単離色素体核を用いたin vitro転写反応を行い、tagetitoxinの阻害効果を比較することにより、これら3タイプの色素体におけるtagetitoxin感受性/非感受性RNAポリメラーゼの相対的な活性の比較を行った。その結果、非光合成型色素体(原色素体およびアミロプラスト)の転写装置はtagetitoxinに対する感受性が低く(阻害率20〜50%)、光合成型色素体(葉緑体)の転写装置は感受性が高い(阻害率95〜98%)ことが判明した。本研究の結果は、非光合成型色素体における色素体遺伝子の転写にはT7ファージ型が、光合成型色素体における転写には大腸菌型が主力となっていることを示唆する。, kaken

  対象リソースIRI
• 特定領域研究(A), 1998 - 1998, 10170208, 光合成能の獲得に伴う色素体およびミトコンドリアの転写-複製活性の変化とその制御機構, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 2100000, 2100000, 本研究は、単離色素体核・ミトコンドリア核を用いたin vitro転写/DNA合成系を活用し、特にDNAおよびRNAポリメラーゼに注目しつつ、(1)これらオルガネラのDNA複製/転写系が互いにどのような影響を及ぼしつつ進化してきたか、(2)植物細胞の増殖・分化過程(特に光合成機能獲得過程)において両オルガネラの複製/転写機能がどのような機構により統合的に制御されているか解明することを目的とする.今年度は、色素体およびミトコンドリアのDNAポリメラーゼの性質の比較ならびに細胞増殖・分化過程におけるオルガネラDNA合成活性の変化について重点的に解析を行った.主要成果は以下のとおりである.
  1. タバコ培養細胞BY-2から単離した原色素体核およびミトコンドリア核はDNA合成活性を保持していた.ゲル内アッセイの結果、両オルガネラ核はいずれも見かけの分子量約116kDaのDNAポリメラーゼを含んでおり、各種クロマトグラフィーにおける挙動も含めて両DNAポリメラーゼの性質は酷似していることが確認された.この結果は、DNAポリメラーゼもT7ファージ型の色素体/ミトコンドリアRNAポリメラーゼのように、オルガネラ間での共通化という方向へ進化してきた可能性を示唆する.
  2. DAPI蛍光顕微鏡観察、定量的サザンハイブリダイゼーション、チミジンのアナログであるBrdUの取り込み、ならびに単離オルガネラ核のin vitro DNA合成活性の測定等の手法を用いた解析の結果、タバコ培養細胞BY-2の増殖過程において、色素体とミトコンドリアのDNA合成活性は植え継ぎ後3〜6時間でほぼ同時に活性化されるが、活性が低下するタイミングは若干異なることが示された.アサガオ花粉およびイネ子葉鞘における観察の結果も、色素体とミトコンドリアのDNAの増加・減少は、互いに独立に制御され得ることを示した., kaken

  対象リソースIRI
• 特定領域研究(A), 1998 - 1998, 10158203, 雌雄異株植物を用いた性染色体と生殖器官特異的遺伝子群に関する分子細胞学的解析, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 2800000, 2800000, 本研究の目的は、性染色体をもちXY型の性決定を行う雌雄異株植物メランドリウム(ヒロハノマンテマ、Silenelatifolia)を用いて生殖器官形成に関わる遺伝子群を単離・同定すると同時に、高等植物の性染色体にコードされる遺伝子群が生殖器官形成に果たす役割を明らかにすることである.特に、雄にしか存在しないY染色体は性決定において重要な役割を担っていると考えられるので、本研究では雄性生殖器官特異的に発現される遺伝子群およびY染色体特異的遺伝子群に解析を集中した.今年度の成果は以下のとおりである.
  (1) レーザーマイクロダイセクションを用いて単離されたY染色体由来の高度反復配列のひとつ、RMY1(repetitive sequence in microdissected Y chromosome)は、チェコのグループがマイクロダイセクションによりメランドリウムX染色体から単離したサプテロメア様配列X43.1に高いホモロジーを示した.FISH解析の結果、RMY1は常染色体を含む多数の染色体末端部分に局在を示したが、性染色体間では局在様式が異なっていた(X染色体は両端、Y染色体は一方の末端).この配列は性染色体の異型化を考察する上で有用な指標になると考えられる.
  (2) 10merのプライマーを用いて雌雄ゲノムDNAを鋳型とするRAPD解析を行い、雄DNAから特異的に増幅されてくるDNA断片を得た,ゲノミックサザンハイブリダイゼーションにより雄特異性を検討し、最も雄特異性が高いと思われたクローンについてSTS化を行い、雄特異的に単一のバンドが増幅されることを示した.inverse PCRにより、その周辺領域の取得を試みたところ、逆転写酵素様のタンパク質をコードし得るORFを含む約9.6kbpのクローンを得た.この配列はY染色体DNAのマーカーとして有用であるとともに、Y染色体特異的遺伝子の有力な候補である., kaken

  対象リソースIRI
• 重点領域研究, 1997 - 1997, 09274205, 光合成能の獲得に伴う色素体及びミトコンドリアのDNA複製活性の変化とその制御機構, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 1400000, 1400000, 本研究の目的は、色素体およびミトコンドリアのDNAおよびRNAポリメラーゼについてその多様性と役割分担を明らかにし、植物細胞進化過程におけるオルガネラゲノム間のクロストークについて考察することである。今年度の成果は、以下の通りである。
  1.タバコ培養細胞BY-2から細胞核、原色素体核、ミトコンドリア核を高純度で単離し、in vitro転写反応を行わせる系を確立した。単離原色素体核のin vitro転写活性は、葉緑体RNAポリメラーゼの阻害剤であるtagetitoxinによって部分的にしか阻害されず、原色素体では葉緑体と性質の異なるRNAポリメラーゼが主カを占めている可能性が示唆された。
  2.タバコ培養細胞BY-2とタバコ成熟葉における色素体遺伝子の発現様式を転写および転写産物蓄積のレベルで比較し、転写と転写産物蓄積との関係を検討した。単離葉緑体核のin vitro転写活性は単離原色素体核の約25倍(鋳型DNA1μgあたり)に達する。転写活性化の程度と転写産物量の増大との間には一定の直線的な関係が成り立ち、色素体転写産物蓄積量の決定において転写レベルでの制御が重要であることが示された。また、BY-2における色素体遺伝子発現の様相は、色素体ゲノムからrpoB(大腸菌型RNAポリメラーゼのβサブユニット遺伝子)を欠失させたタバコ(Alisonら、1996)における色素体遺伝子発現の様式に類似しており、BY-2の原色素体においては色素体コードの(大腸菌型)RNAポリメラーゼの役割が相対的に小さいと推測された。
  3.BY-2から単離した原色素体核のin vitro転写活性はtagetitoxinに比較的耐性であるのに対し、タバコ葉肉細胞から単離した葉緑体核の転写活性は感受性が高いことを明らかにし、分化にともなう色素体転写装置の性質の変化を示した。
  4、BY-2から単離した原色素体核およびミトコンドリア核に存在するDNAポリメラーゼの性質(鋳型選択性等)についてゲル内DNAポリメラーゼアッセイ法および単離核のin vitroDNA合成系を用いて検討し、その類似性を示した。, kaken

  対象リソースIRI
• 重点領域研究, 1997 - 1997, 09262204, 雌雄異株植物を用いた性染色体と生殖器官特異的遺伝子群に関する分子細胞学的解析, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 1200000, 1200000, 本研究では、性染色体をもちXY型の性決定を行うナデシコ科の雌雄異株植物メランドリウム(Silene latifolia)を材料に用いて、雄性生殖器官特異的に発現する遺伝子と雄ゲノム特異的なY染色体との関連について解析を行っている。今年度の成果は以下の通り。
  1.ディファレンシャルスクリーニングにより単離した4種類の雄性生殖器官特異的(Male Reproductive Organ Specific)遺伝子(MROS1-4)のうち、MROS3のゲノミッククローンをinverse-PCRを用いて単離した。約4kbpと3kbpの2種類のクローンが得られた(MROS3AおよびMROS3Bと命名)。両者のORF部分は93.3%の高い相同性を示すが、上流域・下流域は有意な相同性を示さない。従来得られていたcDNAに対応するMROS3Aの転写領域中の3非翻訳領域には、162bpの非自律性トランスポゾン様の挿入配列が認められた。単離したゲノミッククローンをブローブとするマルチカラーFISHを行った結果、MROS3AおよびMROS3B遺伝子は常染色体の末端部にマップされ、性染色体上には存在していないことが明らかになった。
  2.メランドリウム根端分裂組織を材料に用いて染色体標本を作製し、UVレーザービームマイクロダイセクションによりY染色体を直接単離した。回収したY染色体1本(0.5pg)をトボイソメラーゼI処理後DOP-PCRにかけ、鎖長200から300bpのY染色体由来DNA断片を増幅した。増幅されたDNA断片の全体をブローブとしてFISHを行うと、雌のゲノムDNAをブローブの200倍量サブレッサーとして加えてあるにも関わらず、Y染色体特異的なシグナルは検出されず、全ての染色体にシグナルが見られた。このことから、メランドリウムのY染色体はその大部分が他の常染色体やX染色体と共通のDNA配列からなり、特異的な反復配列は蓄積していないと考えられる。また、Y染色体由来DNAのライブラリーからY染色体の末端部分由来である可能性の高いクローンが一つ得られたので、現在解析している。, kaken

  対象リソースIRI
• 奨励研究(A), 1996 - 1996, 08740612, 細胞増殖及び色素体分化にともなう植物ミトコンドリアゲノムの機能的分化, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 1000000, 1000000, タバコ培養細胞BY-2からミトコンドリア核を単離する手法を確立した。この際、細胞核と色素体核も同時に単離することができる。対数増殖期の細胞約10^9個を出発材料とした場合、ミトコンドリア核の収率は5%で、収量は80μgDNAであった。サザンハイブリダイゼーションにより細胞核DNAおよび色素体DNAの混入率を測定した結果、単離ミトコンドリア核の純度は98%であった。分化にともなうミトコンドリアゲノムの機能変化を明らかにするために、タバコ緑葉からミトコンドリア核を単離する方法の開発も行っているが、収量の点でなお改善が必要である。BY-2から単離したミトコンドリア核を適当な条件下でインキュベートすると、[5,6-^3H]UTPを高分子画分に取り込む活性を示す(7pmol/μgDNA/hr)。この活性はDNAおよびタンパク質に依存したRNA合成であり、アクチノマイシンDやEB、N-ethylmaleimide、ヘパリンにより阻害されるが、α-アマニチン、リファンピシン、タゲチトキシン、ナリジキシン酸、及びノボビオシンでは阻害されない。in vitroで合成されたRNAは、ミトコンドリアDNAと特異的にハイブリダイズした。単離ミトコンドリア核はまた、[5-^3H]dCTPの取り込み活性も示す(48pmol/μgDNA/hr)。この活性はDNAおよびタンパク質に依存したDNA合成であり、アクチノマイシンDやEB、N-ethylmaleimide、ddCTP、ヘパリンにより阻害されるが、アフィデイコリン、ナリジキシン酸、ノボビオシンでは阻害されない。in vitroで合成されたDNAの制限酵素解析の結果、DNA合成はミトコンドリアDNAの全領域にわたって起きていることが明らかになった。また、ミトコンドリア核構成タンパク質をSDS-PAGE後、ゲル内DNAポリメラーゼアッセイにかけたところ、分子量約116kDaのDNAポリメラーゼが検出された。本研究の結果、単離ミトコンドリア核のDNA合成反応の至適条件や各種阻害剤に対する応答、DNAポリメラーゼの分子量などは、単離色素体核のそれらと極めて類似していることが明らかになった。この色素体及びミトコンドリアのDNA合成装置の類似性は、両オルガネラのDNAの合成が、細胞増殖初期にそろって活性化される機構を説明するものかもしれない。, kaken

  対象リソースIRI
• 奨励研究(A), 1995 - 1995, 07740613, 色素体ゲノム機能を制御する色素体核構築タンパク質の同定と単離, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 1100000, 1100000, タバコ培養細胞BY-2の色素体は、オーキシン(0.2mg/1の2,4-D)を含む通常の培地中では未分化名原色素体の状態を保つが、オーキシンのかわりにサイトカイニン(1mg/1のBA)を含む改変培地中では大量のデンプンを蓄積し、アミロプラストへと分化する。一方、タバコ植物体の葉肉細胞中には葉緑体が存在する。これら3種の色素体からそれぞれの色素体核(DNA-タンパク質複合体) を単離し、色素体ゲノムの転写・複製活性を比較した。原色素体の場合、細胞の増殖初期過程で一過的にDNA合成が活性化されるが、転写活性はほぼ一定のレベルを保つ。アミロプラスト分化過程では、DNA合成、転写ともに活性は低下する。成熟した葉緑体では原色素体に比べDNA合成活性は約1/4に低下しているが、転写活性は約15倍に上昇していた。このようにそれぞれ特徴的な機能を示す原色素体核、アミロプラスト核、葉緑体核を構成するタンパク質のうち、DNA結合性タンパク質をサウスウェスタン法により比較した。原色素体核およびアミロプラスト核に共通する主要なDNA結合性タンパク質は78, 64,および50kDaである。その他に原色素体核およびアミロプラスト核に特異的なDNA結合性タンパク質も検出されている。また、葉緑体核の主要なDNA 結合性タンパク質は120, 70, 50,および26kDaであった。これらのDNA結合タンパク質の殆どは3M Nacl/5M尿素処理により可溶化されるが、葉緑体核特異的70-および26-kDaタンパク質は一部不溶性画分に残留する。これら難溶性のDNA結合タンパク質は葉緑体核と膜系との結合に関与している可能性がある。また、単離原色素体核を用いてゲル内アッセイ法により色素体ポリメラーゼ(116 kDa)を検出した。現在、このDNAポリメラーゼ量の変化と色素体ゲノムの複製活性との間に相関関係が見られるかどうか検討している。, kaken

  対象リソースIRI
• 奨励研究(A), 1994 - 1994, 06740590, 色素体分化過程における色素体ゲノムの機能変化とその制御機構に関する研究, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 900000, 900000, 最初に、色素体ゲノムの機能解析に用いる単離色素体核の性格付けを行った。単離色素体核は高次構造がよく保たれ、転写・DNA合成活性も高いうえ、可溶性のDNA/RNAポリメラーゼやヌクレアーゼの活性をほとんど含まない等、転写・複製活性の測定に適している。本研究では、単離色素体核のin vitro転写・DNA合成系を用いて、タバコ培養細胞のBY-2の原色素体とアミロプラスト、およびタバコ葉肉細胞の葉緑体の三者について色素体ゲノムの転写・複製機能を比較した。通常の培養条件におけるBY-2の増殖過程では、原色素体ゲノムの複製は細胞増殖の極初期(植え継ぎ後24時間以内)に一過的に約5倍に活性化され、原色素体DNA量は著しく増加する。一方、転写活性は培養過程を通じてほぼ一定である。また、アミロプラスト分化を誘導したBY-2では、色素体のDNA複製はあまり活性化されず、転写活性も誘導開始後24-48時間で1/3から1/4に低下する。しかし、転写産物量は減少しないことから、アミプラストでは転写産物の寿命が極端に長いと考えられる。この時、psbA遺伝子の転写活性は例外的に比較的高く保たれ、そのmRNAは増加を続けることがわかった。一方、葉肉細胞の葉緑体とBY-2の原色素体の比較では、単離葉緑体核の転写活性は単離原色素体核の約15倍の値を示したが、DMA合成活性は約1/3と低かった。転写活性の増大の程度は個々の遺伝子ごとに異なり、転写の活性化と転写産物量の増大の間には正の相関がみられた。この結果は、葉緑体分化にともなう色素体遺伝子の発現制御には、転写レベルでの制御が重要であることを示唆する。単離色素体核のDNAタンパク質をサウスウェスタン法により調べたところ、それぞれの色素体核に特徴的なDNA結合タンパク質が検出された。DNA結合タンパク質の違いが色素体核の構造と転写・複製機能に及ぼす影響を探るため、単離色素体核をDNAとタンパク質に解体した後、再構成する系を現在開発中である。, kaken

  対象リソースIRI
• 重点領域研究, 1994 - 1994, 06269206, タバコ培養細胞系におけるアミロプラストの誘導と細胞肥大のホルモンによる制御, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 2800000, 2800000, タバコ培養細胞BY-2は、合成オーキシンである2,4-D(0.2mg/l)を含む通常の培地中では活発に細胞増殖を行い、その色素体は培養の全期間を通じて未分化な原色素体の状態を保つ。一方、2,4-Dを含まず、合成サイトカイニンであるBA(1mg/l)を添加した改変培地中では細胞はほとんど増殖せずに著しく大型化し、色素体は大量のデンプンを蓄積してアミロプラストに変換する(Sakai et al.1992)。今年度は、BY-2細胞の植物ホルモンに対する応答を詳細に解析し、アミロプラストの分化誘導に関しては-2,4D,+BAの条件が最良であることを確認した。しかし、ホルモンを全く含まない(-2,4-D,-BA)培地中でもデンプンの蓄積が認められることから、BY-2のアミロプラスト分化誘導では2,4-Dの除去が第一の要因であり、BAは2,4-Dの除去によって生じる変化を促進していると考えられる。それぞれのホルモンに対する応答を調べた結果、2,4-Dは細胞増殖を促進し、デンプン蓄積を抑制すること、BAは逆に細胞増殖を抑制し、デンプン蓄積を促進すること、そしてこれらの反応はホルモン濃度依存的であることが確認された。2,4-DとBA以外のオーキシンやサイトカイニンも類似の作用を示すことから、これらはオーキシン、サイトカイニンに共通の効果であると考えられる。各種培養条件を比較すると、細胞増殖率の低下とデンプン蓄積量の増大は平行関係にあった。しかし、真核型ポリメラーゼαの阻害剤であるアフィディコリンを添加して細胞の増殖を強制的に停止させても、デンプンの蓄積量は培地の種類ごとに明らかに異なっていた。したがって、デンプンの蓄積は増殖率の低下によって二次的にもたらされるのではなく、ホルモンにより独自の制御を受けていると考えられる。また、単離色素体核を用いたin vitroアッセイ系によりアミロプラスト分化過程における色素体ゲノムの機能変化を調べた結果、転写・複製活性ともに不活発であることが明らかになった。, kaken

  対象リソースIRI
• 奨励研究(A), 1993 - 1993, 05740476, アミロプラストの分化過程における色素体遺伝子の発現制御とその分子機構, 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 1000000, 1000000, タバコ培養細胞BY-2は、オーキシン(2,4-D;0.2mg/l)を含む通常培地中では未分化な原色素体をもつが、オーキシンを含まずサイトカイニン(BA;1mg/l)を添加した改変培地に植え継ぐと、細胞内の色素体は大量のデンプンを蓄積し、約48時間でアミロプラストへと分化する。このアミロプラスト分化誘導系を用いて、アミロプラストの分化過程における色素体遺伝子の発現制御様式を解析した。アミロプラスト分化過程では細胞数はほとんど増加せず、細胞当たりの色素体数、色素体DNAコピー数も分化過程を通じてほぼ一定であった。この過程における色素体遺伝子の転写活性の変化を調べるため、経時的に色素体核を単離し、そのin vitro転写活性を測定した。単位DNAあたりの転写活性は誘導開始6時間後に一過的に上昇した後急速に低下し、48時間後には誘導開始時の25%程度に減少した。9種類の代表的な色素体遺伝子の転写活性の変動をハイブリダイゼーションにより調べたところ、atpA,atpB,rpoB,petB,rbcL,rpl16,23SrRNA遺伝子の転写活性は一過的に上昇した後、誘導開始時の数%にまで減少するが、psbA(光化学系II反応中心32kDaタンパク質遺伝子)とpsaA-B(光化学系Ip700アポタンパク質A1/A2遺伝子)の転写活性はアミロプラスト分化過程を通じて比較的高く、誘導開始時の30-50%に保たれることが分かった。さらに、色素体転写産物蓄積量の変化を調べたところ、多くの色素体遺伝子の転写産物量は誘導開始直後に一過的に上昇した後、そのまま一定の値を保つか漸減したのに対し、psbaおよびpsaA-B転写産物量はアミロプラスト形成過程を通じて増加を続けた。転写産物蓄積量の変化とin vitro転写活性の変化は概ね一致する。しかし、多くの色素体遺伝子の転写活性が著しく低下した後においてもそれらの転写産物量は比較的一定のレベルを保っていることから、アミロプラストにおける転写産物の分解速度は極めて遅いことが示唆された。, kaken

  対象リソースIRI
• 重点領域研究, 1992 - 1992, 04257203, 単離オルガネラ核の解体と再構成による高等植物の色素体遺伝子発現機構の解析, 河野 重行; 酒井 敦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 東京大学, 2900000, 2900000, 細胞分化の柔軟性は植物細胞で特に著しく,オルガネラの分化にも高い柔軟性が要求される.なかでも色素体は著しい可塑性を有しており,細胞機能に応じて様々に発達・分化し得る.色素体の遺伝子発現制御機講を解析するためには,特微的な遺伝子発現パターンを持つ異なる型の色素体核を無傷単離し,それらを解体・再構成し、転写パターンを比較検討できることが望ましい.
  タバコ培養細胞BY-2はこのような研究に理思的な系であるが,培養過程でのオルガネラの発達・分化の様式は明らかにされていない.DAPI染色-抗BrdU抗体免疫蛍光顕微鏡法や定量的サザンブロット法を用いて,通常の培養過程や培養条件を変更した際のオルガネラの挙動を解析した。その結果,原色素体やミトコンドリアのDNA合成は細胞増殖が活発になる直前に,最大になり,細胞核の分裂が活発になる時期には逆に減少することを明らかにした.また,培養7日目の定常期にあるBY-2を2,4-Dを除き6-benaylaminopurine(1mg/l)を添加した改変Linsmaier and Skoog培地に植え継ぐと,原色素体は12時間目頃から澱粉を蓄積し,48時間目頃にはほとんどがアミロプラスト化することを明らかにした.
  このような培養系を用いて,原色素体核を無傷単離し,単離色素体核の解体・再構成実験を行った.単離原色素体核をNaCl処理し,タンパク質を段階的に外し,原色素体核の構造と転写活性を解析した.NaCl濃度を上げると,0.1Mで31,30kDaの,0.7Mで69,14kDaのタンパク質が外れ,原色素体核の構造が拡散し,転写活性は著しく減少し,転写産生の構成も著しく変化した.解体した原色素体核を含む溶液のNaCl濃度を段階的に下げると,原色素体核が再構成されるが,再構成した色素体核のin vitro転写効率は解体時を上回ることはなかった.このような再構成系では,核構造が見かけ上再成されても,転写機能に関与する要素の再構成が十分でないことがわかる.今後,核構造の構築に関与するDNA結合タンパク質とRNA合成酵素等の転写機能に直接関与する因子を分別単離し,転写機能を保持した色素体核の再構成系の開発を試みる予定である., kaken

  対象リソースIRI