Research Projects

• 基盤研究(B), 01 Apr. 2022 - 31 Mar. 2025, 22H02096, オキソ配位子のプロトン化による金属ジオキソ錯体の活性化とC-H活性化反応の開発, 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 17420000, 13400000, 4020000, kaken

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• Oct. 2016 - Mar. 2023, Principal investigator, 配位環境制御および反応環境制御によるメタン酸化触媒の開発, 藤井 浩, CREST, 0, 0, 0, Competitive research funding
• Apr. 2019 - Mar. 2022, Principal investigator, マンガン4価サレン錯体の配位子場による不斉構造の制御とその分子機構の解明, 藤井 浩, 科研費 新学術領域 公募研究, 0, 0, 0, Competitive research funding
• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 01 Apr. 2017 - 31 Mar. 2020, 17H03032, Study of reactions of hypochlorite with metal complexes and metalloenzymes, Fujii Hiroshi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nara Women's University, 18590000, 14300000, 4290000, The bond cleavage processes of metal bound hypochlorite were studied to reveal the mechanism determining the bond cleavage fashion of various metal bound terminal oxidants. The reactions of heme with hypochlorite were studied with various spectroscopic methods at low temperature. The products from these reactions were also analyzed in detail. These analyses allowed us to propose a new mechanism, which can predict the bond cleavage fashion of various terminal oxidants. In addition, the mechanism controlling the reactivity of the metal bound terminal oxidants was studied with heme complexes. The reactivity of the terminal oxidants can be interpreted by the orbital interactions of the metal d-orbitals with ligand orbitals., kaken

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• Apr. 2017 - Mar. 2020, Principal investigator, 酸化反応に関わる金属酵素の機能発現の分子機構の研究, 藤井 浩, 科研費 基盤B, 0, 0, 0, Competitive research funding
• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 01 Apr. 2013 - 31 Mar. 2017, 25288032, Reactivity and Selectivity of Hypochlorite Adducts of Metal Complexes, Fujii Hiroshi; HADA Masahiko; OGURA Takashi; ADACHI Shinichi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, 18720000, 14400000, 4320000, In this project, we studied how hypochlorious acid is produced from the reaction of a high-valent oxoiron complex with chloride. This study points out that the key factor to produce hypochlorious acid is the reactivity of the high-valent oxoiron intermediate that is controlled by unique coordination structures of the active sites in the enzymes. In addition, we studied how the reactivity of the hypochlorite adduct complex is controlled. The most important factor to control the reactivity of the complex is electron donor ability form the cis- and trans-ligands. Interestingly, the electron donor effect of these two ligands show different trend to the reactivity., kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 2010 - 2012, 22350030, Molecular Mechanism Controlling Reactivity and Selectivity of High-Valent Oxo-Metal Complexes, FUJII Hiroshi; KURAHASHI Takuya; HADA Masahiko, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities, 19370000, 14900000, 4470000, In this project, we studied how the reactivity and selectivity of high-valent metal-oxo complexes are controlled to provide a new concept fordeveloping functional catalysts.We succeeded in revealing a new unique molecular mechanisms that the axial ligand controls the reactivity of oxoiron(IV) porphyrin π-cation radical complex by stability of the iron(III) porphyrin complex, not by instability of itself. In addition, we succeeded in solving the crystal structure of a chiral manganese(IV) salen iodosylarene adduct, which provide a new mechanism for controlling its enantioselectivity, kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 2010 - 2012, 22350010, Quantum-Chemical Study on Magnetic Molecular Properties andChemical Reactions in Excited States Based on the RelativisticSAC-CI Theory, HADA Masahiko; HASEGAWA Junya; FUJII Hiroshi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Tokyo Metropolitan University, 16770000, 12900000, 3870000, The main purpose of this project is to make a new theoretical and computational development of the higher-order relativistic GUHF-CCSD-CI method for chemical reactions and chemical phenomena in the electronic excited states, for example, photochemical reactions and fine potential energy surface considering the spin-orbit interaction and the intersystem crossing. In the GUHF-CCSD-CI method, the GUHF orbitals are used as reference and the CCSD is used for the electronic ground state. We finished the computer code of the GUHF-CCSD-CI method, and we applied this code to calculations of the singlet and triplet excited states and checked the accuracy in comparison with the non-relativistic CCSD, SO-CASPT2. The GUHF-CCSD-CI is meaningfully more accurate than the other methods. The SO-CASPT2 is accurate in light elements but not in heavy elements. Further, we carried out some relativistic quantum-chemical calculations for compounds containing heavy-elements., kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 2004 - 2006, 16350094, Control of Regioselectivity of Heme Oxygenase by Reconstruction of Hydrogen-Bonding Interactions between Substrate and Enzyme, FUJII Hiroshi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, National Institutes of Natural Sciences, 15600000, 15600000, Regioselective reactions catalyzed by enzymes are very important biologically and chemically. Therefore, molecular mechanisms of regioselective reactions have been studied for various enzymes with various spectroscopic methods. We have studied the molecular mechanism of heme oxygenase (HO), which catalyzes regioselective degradation of heme (iron protoporphyrinIX) to α-biliverdin, CO, and free iron ion. Interestingly, HO regiospecifically oxidize the α-meso position of the heme to form α-biliverdin isomer while non-enzymatic heme degradation forms all four possible α, β, γ, δ-biliverdin isomers at nearly identical yield. We have found two essential amino acid residues, Asp-140 and Arg-183 in rat-HO, for the a-regioselective heme degradation. We showed that the Asp-140 and Arg-183 residues control oxygen activation process and the substate (heme) binding process via hydrogen-bonding interactions, respectively. With combination of the Asp-140 and Arg-183 residues, the a-meso position of the heme is placed at the nearest position from the activated oxygen species, resulting in the a-regioselective reaction. This mechanism let us imagine that we can switch the regioselectivity of HO if we can control an orientation of the heme in HO so that the other meso position is placed at the nearest position from the activated oxygen species. To realize this idea, on the basis of the crystal structure of the wild type HO, we designed a mutant, in which the other meso position is placed at the nearest position from the activated oxygen species. In this project, we succeeded in conversion of α-selective HO to δ-selective HO with the present strategy. Furthermore, we also succeeded in controlling heme orientation in HO with mutation of amino acid residues, which results in β-selective and δ-selective HO., kaken

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• 特定領域研究, 2005 - 2005, 17036071, 金属酵素のナノ反応空間における基質の配向および反応選択性の制御, 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(共通施設), 1400000, 1400000, 酵素反応は高い立体および位置選択性を示す。これは、酵素が作る反応場の構造に由来している。酵素の反応場には基質結合サイトと活性サイトがあり、基質結合サイトは基質のある特定部位が活性サイト近傍になるように基質を固定している。そのため活性サイトから攻撃をうける部位は限定され、高い反応選択性を示すのである。我々はこの考えを逆手にとり、基質の中で我々が反応させたい部位が活性サイト近傍に位置するように酵素内で新たに基質結合サイトを再構築することができれば、ひとつの酵素からさまざまな物質を立体選択的に合成できると考えた。そこで本研究ではこの考えを検証するため、ヘムオキシゲナーゼを用いて本手法に基づいた反応選択性の人為的制御を試みた。ヘムオキシゲナーゼは、生体内で不要になったヘムタンパク質から遊離したヘムを酸化的にビリベルジンと一酸化炭素と鉄イオンに分解する酵素である。多くのヘムオキシゲナーゼはヘムのα位を酸化的に解裂させるようなα選択性をもつ。ヘムオキシゲナーゼの立体構造を基に基質結合サイトを再設計(リホーム)し、α異性体以外の我々が望む選択性をもった酵素に人工的に変換することをめざした。本年度の研究により、α選択性をもった酵素の活性中心を先に示した方針に従い再構築することにより、δ選択性をほぼ100%示す酵素に変換することに成功した。酵素の立体構造解析の結果、基質の配向が設計どおり変化していることが明らかになった。さらに、β選択性をもつ酵素に変換するための基礎的知見を得た。ヘムの配向に2つのアミノ酸残基が関わっていることを明らかにした。これにより、β選択性酵素の作成への手がかりを得ることができた。, kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 2002 - 2003, 14340212, Synthesis and Characterization of High Valnet Reaction Intermediate of Non-Heme Iron Enzymes, FUJII Hiroshi; KURAHASHI Takuya, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Okazaki National Research Institutes, 15000000, 15000000, High-valent iron-oxo species are proposed to be the key reactive intermediate in oxidation reactions catalyzed by both heme and non-heme iron enzymes. In the case of heme enzymes, porphyrin model complexes have been extensively investigated, and oxo-iron (IV) porphyrin π-cation radical have been characterized as the most probable candidate for the active species. However, it is still unclear whether such high-valent iron-oxo species are generated from mononuclear non-heme iron active sites, in which there is no electron pool that can replace the large π-conjugation of the porphyrin ring. It is thus worth challenging to prepare transient oxidizing species from a mononuclear non-heme iron model complex for a detailed study of the electronic structure in comparison with the heme case. To this end, we have prepared a salen iron complex having a mesityl substituent, as a model for mononuclear iron enzymes. We have also tried to make a transient intermediate generated from the sterically hindered salen iron complex and m-chloroperoxybenzoic acid (mCPBA)., kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas, 2001 - 2003, 13125208, Development of heme-based highly efficient biocatalysts, SHIMADA Hideo; FUJII Hiroshi; HAYASHI Takashi; MUKAI Kuniaki, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, KEIO UNIVERSITY, 40600000, 40600000, As a research intended to construct heme-based highly efficient biocatalyst, we have developed a functional expression system of bovine/human hybrid cytochrome oxidase in human HeLa cells by integrating the bovine mitochondrial DNA derived subunit I gene into the cell genome, whose product is the largest with 12 trans membrane helices in the 13 different enzyme-subunits and essential to the function. The expression and subsequent import of subunit I into the inner membrane of mitochondria permit the association with the other 12 human subunits leading to the hybrid enzyme having the same dioxygen reduction and proton pumping activities as those of the human enzyme, In this system, the hybrid dominates over the human enzyme. By mutating the subunit I, we have found the key residue for the proton pumping and also demonstrated that the proton pumping can be uncoupled from the dioxygen reduction. The methods we have developed ale applicable to cure mitochondrial diseases caused by mal-function of mitochondrial DNA derived membrane proteins. We have also developed the cell-free functional synthesis of Paracoccus denitrificans cytochrome oxidase by exogenously adding the prosthetic group into E. coli reaction system.
  The prosthetic group, protoheme, of myoglobin (Mb) can be chemically modified to functionalize the protein as monooxygenase, peroxygenase and peroxidase. Incorporation of unnatural heme, metalloporphycene, into Mb turned out to enhance the oxygen affinity to 1000-fold. Protein engineering of Mb with the above porphycene powers up the oxidizing activity enormously to allow the oxidative destruction of bisphenol A, a notable endocrine disrupter. These results revealed that unnatural heme including chemically modified are powerful to develop a protein-based efficient catalyst.
  Our in vivo and in vitro functional expression system of cytochrome oxidase pave the way to produce a highly efficient biocatalyst from highly hydrophobic membrane proteins by combining the protein engineering with an incorporation of unnatural heme into the active center., kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (C), 2000 - 2001, 12680625, Relation between the structure and the oxygen acitivation of heme oxygenase reaction, YOSHIDA Tadashi; FUJII Hiroshi; ZHANG Xuhong, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, YAMAGATA UNIVERSITY, 3700000, 3700000, (1)The hemin complex of HmuO, a 24-kDa soluble heme degradation enzyme in Corynebacterium diphtheriae, is coordinated axially to a neutral imidazole of a proximal histidine residue in HmuO. EPR of the NO-bound ferrous heme-HmuO mutant complexes reveals His20 as the proximal heme ligand in HmuO, and this is confirmed by resonance Raman result from the ligand free ferrous heme-H20A. When bound with exogenous imidazole, His20A mutant resumes full catalytic activity. Hence, it is the absence of the proximal His ligand, that is responsible for the inactivity of proximal His mutant.
  (2)We found that the mutation of R183 to E or D of rat HO-1 changes the a-regioselectivity of the HO catalysis. The result shows the importance of the hydrogen bonding interaction between the arginine at position 183 and the carboxylates of the heme propionate group, as well as steric effect of the distal helix, for the a-regioselectivity.
  (3)Wild-type enzyme of rat HO-1 degrades heme to verdoheme with hydrogen peroxide. However, D140A heme complex forms compound II with hydrogen oeroxide, and no heme degradation occurs. D140E mutant degrades heme normally, but D140N shows reactivity similar to that of D140A. These results indicate that the carboxylate at position 140 is essential to activate the iron-bound oxygen.
  (4)We determined the crystal structure of rat biliverdine reductase. The structure contains two domains: an N-terminal domain characteristic of a nucleotide binding fold and a C-terminal domain. We proposed modes of binding for NADPH and biliverdin., kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (C), 2000 - 2001, 12640549, Functional Alteration of Myoglobin to Nitrite Reductase by Synthetic Heme and Protein Mutations, FUJII Hiroshi; FUNAHASHI Yasuhiro, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Cente for Integrative Biosience, 3700000, 3700000, In this project, we tried to alter the function of myoglobin, which serves as an oxygen storage in a muscle, to nitrite reductase, which reduces nitrite anion to nitric oxide in denitrification process. To prepare the artificial nitrite reductase from myoglobin, we first synthesized the active site model heme of the nitrite reductase. Since heme-d_1, which has been known as an active site of the nitrite reductase, has a dioxoisobacteriochlorin core, we prepared dioxoisobacterichlorin from dimethyldeutrioporphyrin with the oxidation by osmium tetraoxide and the pinocol rearrangement. The absorption spectrum of the synthesized heme-d_1 model was similar to that of nitrite reductase, suggesting the heme-d_1 model works as an active site of the artificial nitrite reductase. Therefore, we further tried to reconstitute the heme-d_1 model into apomyoglobin. The heme-d1 model formed a stable 1 : 1 complex with the apomyoglobin. The spectroscopic data of the complex were close to those of nitrite reductase. On the basis of these results, we further tried to add the protein mutations into the complex. We prepared L29H/F45H/H64Y myoglobin mutant because the structure of the mutant seems to be close to that of nitrite reductase. The mutant myoglobin was successfully expressed by e-coli and isolated. The triple mutant was also formed stable complex with heme-d1 model complex. The artificial nitrite reductase mimics not only the spectroscopic properties but also the reactivity of nitrite reducatse., kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 2000 - 2001, 12480176, Structure and Function of heme related proteins involved in intracellular signal transduction, IKEDA-SAITO Masao; TOMITA Takeshi; FUJII Hiroshi; SHIRO Yoshitsugu; MATSUI Toshitaka; HIROTSU Shoko, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, TOHOKU UNIVERSITY, 2200000, 2200000, In this work, we studied about heme oxygenase, a heme degradation enzyme. First, our research project was focused on constitutive isoform of mammalian heme oxygenase, HO-2. Recombinant HO-2 overexpressed in E colli. was successfully purified with new method to exclude impurity such as degradated or denatured enzymes. We used this highly purified HO-2 for crystal screening to search an appropriate buffer condition of crystallization, but we could not find the condition. On the other hand, we had already made crystal of HmuO, a bacterial heme oxygenase, and tried to elucidate crystal structure of HmuO. On the basis of spectroscopic data, optical absorption and resonance Raman spectra, and enzymological analysis of HO-2 and HmuO, their heme environment and reaction mechanism were found to be identical to those of HO-1 , inducible form of mammalian heme oxygenase. X-ray crystal structure analysis revealed that the crystal of HmuO belonged to P21 space group and a unit cell of the crystal was composed of three molecules. We could reveal structure of oxidized form and reduced form, the first and second intermediate of the enzyme reaction. The reduced form of crystal was made by the addition of sodium dithionite as an electron donor to the oxidized form crystal. Resolutions of the crystal structures were 1.4 and 1.7 angstroms for oxidized form and reduced form, respectively. From the comparison of crystal structures in oxidized and reduced forms, substantial amount of structural changes provoked by changing of heme iron electronic state were discovered for the first time. Additionally, presence of an hydrogen bonding network, which is assumed to work as a proton donor in the heme-degradation reaction, was pointed out here. Now our efforts are thrusting to realize the structure of CO adduct of HmuO as well as other intermediate, alpha-hydroxyheme form, verdoheme form, and billiverdin form., kaken

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• 特定領域研究(A), 1999 - 1999, 11116229, ^<17>O-NMRによる銅-酸素錯体の配位した酸素の電子構造と反応性の研究, 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 岡崎国立共同研究機構, 1500000, 1500000, 生体内には、チロシナーゼやヘモシアニンに代表されるような銅イオンを活性中心にもつ酵素が数多く存在する。ヘモシアニンは、無脊椎動物(たこやいかなど)の酸素運搬体であり、チロシナーゼはチロシンなどの酸化を行う酵素である。これら酵素の酸素付加体の構造は、ともに酸素が2つの銅イオンに対してサイドオンで配位したη_2η_2構造をもつが、ヘモシアニンに配位した酸素は可逆的に吸脱着するのに対して、チロシナーゼに配位した酸素は、活性化され基質(チロシンなど)に添加される。類似の構造をとるにもかかわらず配位した酸素の反応性が異なるのである。さらに同様な現象は、これまでの銅2核酸素錯体の反応性にも見られる。エンドオンの形態をとる場合は、配位した酸素の反応性は低く、むしろ酸素は可逆的に吸脱着するが、サイドオンの形態をとる場合は、基質を酸化することができる。
  今回我々は、η_2η_2構造をもつ銅-酸素不可錯体を合成し、銅イオンに配位した酸素の^<17>O-NMR測定を行った。10%-^<17>O-エンリッチの酸素ガスから合成した酸素錯体の^<17>O-NMR測定を行った。-60度以上の温度で配位した酸素のシグナルが200ppmに観測された。温度による化学シフトの変化は観測されず、銅イオンからの常磁性の効果がないことがわかった。今回観測されたシグナルのシフトは、過酸化水素の酸素と同様の位置であり、配位した酸素がパーオキソ状態に2電子還元されていることを示した。また、配位子の違いによる化学シフトの大きな変化は観測されなかった。これらの実験から、今回観測されたシフトはη_2η_2構造をもつ酸素分子に特徴的なシフトであることが示唆された。今後さらに、配位構造が異なる錯体を合成して、その^<17>O-NMRを行い、酸素活性化を支配する因子の解明をめざす。, kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (A)., 1998 - 1999, 10044233, Mechanism of heme degradation by heme oxygenase, YOSHIDA Tadashi; FUJII Hiroshi; SATO Michihiko; ZHANG Xuhong; MIGITA Taiko, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, YAMAGATA UNIVERSITY, 9400000, 9400000, (1)To identify the axial heme ligand of heme oxygenase-2 (HO-2), we prepared His45 to Ala (H45A) mutant. H45A was completely devoid of the heme dedradation activity. A 5-coordinate-type ferrous NO EPR spectrum was observed for the heme-H45A complex. These indicate that His 45 is the proximal ligand of heme oxygenase-2. (2)The OィイD22ィエD2 and CO reactions with the heme, hydroxyheme, and verdoheme complexes of HO were studied. The OィイD22ィエD2 affinities for heme and hydroxyheme are very high, but the CO affinities are only 1-6-fold higher than the OィイD22ィエD2 affinities. Thus, HO discriminates much more strongly against CO binding than myoglobin. (3)On the basis of Raman spectra of OィイD22ィエD2-bound form of the heme-HO complex, a highly bent Fe-O-O geometry has been proposed. However, the interaction of bound oxygen with the distal amino acid residue has not been identified.
  To clarify this, we have carried out EPR measurements of the cobalt(II) porphyrin HO complex and revealed that the bound-OィイD22ィエD2 formes hydrogen-bond interactions with distal amino acid residue. (4)We investigated the mechanism of the conversion of hydroxyhemin to verdoheme and confirmed that our previous conclusion that this step requires one reducing equivalent along with molecular oxygen. (5)We analyzed the first step of the heme degradation. We found that the molecular oxygen bound to heme-HO complex is stabilized by an H-bond and that hydroperoxy-HO genarated by cryoreduction catalyzes the formation of hydroxyheme. (6)We established the expression system of bacterial HO (Hmu O). Hmu O binds hemin stoichiometrically to form a hexacoordinate high spin hemin-Hmu O complex. When ascorbic acid is used as the electron donor, Hmu O converted hemin to biliverdin with hydroxyhemin and verdoheme as intermediates. Other enzymatic and protein-chemical properties closely resembled those of mammalian HOs., kaken

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• 特定領域研究(A), 1998 - 1998, 10129101, ヘムオキシゲナーゼの構造と機能との関連(特に酸素活性化について), 吉田 匡; 右田 たひ子; 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 山形大学, 1700000, 1700000, ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘムをビリベルジン,CO,鉄イオンに分解する.私共は長年本酵素によるヘム分解機構と中間過程の解析を行ってきた.最近,本酵素が病原性細菌にも存在することが知られるようになった.そこで私共は細菌のHOについても興味を持ち研究を始めた. 或る種の病原性細菌では増殖のみならずその病原性の発現の為に鉄を必要とする.即ち,これらの菌では蛋白質性毒素の遺伝子のプロモーター領域に鉄調節エレメントがあり鉄要求性に転写が促進される.一方,宿主には遊離の鉄は極微量しか存在しないためこれら細菌では鉄獲得の為に何等かの機構が必要となる.そのうちの一つに宿主を溶血させ遊離したヘモグロビンからヘムを奪い,それを菌体内に持ち込み,ヘムを分解して鉄を得る,という機構がある. 1997年にSchmittはCorynebacterium diphtheriaeに動物のHOにホモロジーを持つ25kDa蛋白質をコードする遺伝子が存在すること,そして翌年にこの蛋白質がヘム分解活性を持つ事を報告している.そこで私共もその塩基配列を化学合成し,大腸菌の発現ベクターであるpMW172に組み込み発現系と精製系を確立した.精製酵素のヘム分解比活性をアスコルビン酸-デスフェリオキサミン系で比較した所,動物系のHOよりは低いが顕著なヘム分解活性が認められた.精製酵素にヘムを加えると1対1で結合し,その光吸収像は動物系と同様にミオグロビンと類似の吸収像を示した.然し,興味深いことに吸収像はpHによって殆ど影響されなかった.従って第六配位座近傍は動物系とはかなり異なると思われる.本酵素に結合したヘムはアスコルビン酸-デスフェリオキサミン系の添加によってベルドヘムを経てビリベルジンまで分解されたので,反応過程は動物系と同じと思われる., kaken

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• 奨励研究(A), 1997 - 1998, 09740504, ヘム酵素の軸配位子が多様な酵素機能を制御する機構の解明, 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 2300000, 2300000, 生体内のヘム酵素は、活性中心にヘムを共通にもつが、活性中心のヘムが担う機能は多種多様である。ヘム酵素がもつ機能の多様性は、ヘムに配位する軸配位子やヘム周辺のタンパク質の作る反応場によると考えられているが、詳細は明らかでない。本研究では、生体内のベルオキシダーゼ、カタラーゼ、サトクロームP-450などのヘム酵素の軸配位子が、その酵素機能をどのように制御しているかをモデル錯体により研究した。本課題による主な成果はつぎの通りである。
  1. これらのヘム酵素は、その反応中にCompound Iと呼ばれる反応中間体を生成するが、その寿命が短いため酵素を用いた詳細な研究は困難である。そこで本研究では、これら酵素と同様な軸配位子をもつCompound Iモデル錯体の合成し、軸配位子の役割りを明らかにした。軸配位子を導入するため、対イオンに過塩素酸イオンを用いること、酸化剤にオゾンを用いることにより、ベルオキシダーゼ由来のイミダゾール基とカタラーゼ由来のフェノール基をもつCompound Iモデル錯体の合成に初めて成功した。
  2. 合成したCompound Iモデル錯体の吸収スペクトルを測定した。軸配位子を導入したCompound Iモデル錯体は、軸配位子をもたない錯体に比べ吸収ピークが長波長側にシフトした。この変化を軸配位子の塩基性と比較すると、塩基性が大きくなるに従い、長波長側に変化することが明らかとなった。この結果は、Compound Iの吸収ピークが酵素により大きく異なるのは、軸配位子の塩基性の違いによることを示唆した。また逆に、Compound Iの吸収位置は、軸配位子からヘム鉄への電子供与の大きさをを反映することを示した。, kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (B), 1997 - 1998, 09480158, Molucular mechanisms of oxygen activation at the three steps in heme oxygenase reaction, YOSHIDA Tadashi; MIGITA Taiko; FUJII Hiroshi; ZHANG Zuhong, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, YAMAGATA UNIVERSITY, 2800000, 2800000, (1)The resonance Raman spectra for alpha-hydroxyheme and verdoheme complexes of heme oxygenase (HO) was measured. We found that the ferric alpha-hydroxyheme and ferrous verdoheme complexes showed atypical Raman patterns, which are interpreted as the result of the symmetry lowering of the porphyrin-conjugating pi-electron system. (2)To identify the axial heme ligand of HO-2, we prepared His45 to Ala (H45A) and Hisi 52 to Ala (Hi 52A) mutants. H45A was completely devoid of the heme dedradation activity. A 5-coordinate-type ferrous NO EPR spectrum was observed for the heme-H45A complex, On the contrary, H152A mutant exhibited spectroscopic and enzymatic properties identical to those of wild-type. His132 of HO-1 was also not important for the heme degradation. (3)The O_2 and CO reactions with the heme, hydroxyheme, and verdoheme complexes of HO were studied. The 02 affinities for heme and hydroxyheme are very high, but the CO affinities are only 1-6-fold higher than the O_2 affinities. Thus, HO discriminates much more strongly against CO binding than myoglobin. The CO affinities of the verdoheme complexes are about 10,000 times weaker than those of the heme complex. (4)On the basis of Raman spectra of O_2-bound form of the heme-HO complex, a highly bent Fe-O-O geometry has been proposed. However, the interaction of bound oxygen with the distal amino acid residue has not been identified. To clarify this, we have carried out EPR measurements of the cobalt(II) porphyrin HO complex and revealed that the bound-O_2 forms hydrogen-bond interactions with distal amino acid residue., kaken

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• 重点領域研究, 1997 - 1997, 09235236, チトクロームC酸化酵素の活性中心モデル錯体の構築とその酸素との反応, 藤井 浩; 吉村 哲彦, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, (財)山形県テクノポリス財団(生物ラジカル研究所), 1700000, 1700000, チトクロームc酸化酵素は、ミトコンドリアにおいてATP合成に関わる金属酵素である。我々は、チトクロームc酸化酵素の反応機構を解明するためモデル錯体の合成を行った。
  1.ヘムa_<3->Cu_B部位モデル錯体の構築 Cu_Bサイトの銅イオンには3つのヒスチジンが配位しているので、これをトリスピリジルメタンによりモデル化した。ポルフィリンとトリスピリジルメタンを化学反応性に強いエーテル結合で連結した。ポルフィリンに鉄3価イオンを、トリスピリジルメタンに銅2価イオンを導入した。合成された錯体は、吸収スペクトル、NMR、ESR、MSスペクトルの測定により、ヘム鉄と銅イオンの間に架橋配位子をもたないこと、磁気的相互作用がないことがわかった。本研究の結果、酵素のヘムa_<3->Cu_Bサイトには架橋配位子が存在することが示唆された。
  2.反応中間体モデルの構築 チトクロームc酸化酵素は、CompoundI類似の反応中間体をとることがラマンスペクトルの研究により明らかにされている。CompoundI中間体の電子構造を解明するため、チトクロームc酸化酵素のCompoundI中間体のモデル化を行った。チトクロームc酸化酵素のヘムa_3は、ヒスチジン由来のイミダゾールを軸配位子としてもつ。配位力の極めて弱い過塩素酸イオンを軸配位子として用いること、また配位性のイオンを生成しないオゾンを酸化剤として用いた結果、イミダゾールを軸配位子としてもつCompoundIモデル錯体の合成に初めて成功した。合成された錯体は、鉄4価ポルフィリンπカチオンラジカル状態であること、HOMO軌道に変化がないこと、配位したイミダゾールにはほとんどラジカル電子が分布していないことが明らかとなった。, kaken

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• 重点領域研究, 1997 - 1997, 09235101, ヘムオキシゲナーゼの構造と機能との関連(特に酸素活性化について), 吉田 匡; 右田 たい子; 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 山形大学, 1700000, 1700000, ミクロソーム酵素であるヘムオキシゲナーゼには二つのイソ酵素がありそれぞれHO-1,HO-2と呼ばれている.ヘムは本酵素によりヒドロキシヘム,ベルドヘム,ビリベルジン・鉄錯塩を経てビリベルジン,CO,鉄イオンに酸化的に分解される.この反応に必要な電子はやはりミクロソーム酵素であるシトクロムP-450還元酵素によって供給される.ヘムだけではなくヒドロキシヘム,ベルドヘムからの反応でもそれぞれ一分子の酸素が利用される.従って,三つの連続したモノオキシゲナーゼ反応が一つの酵素蛋白の上で起こっていることになる.
  COはヘムの二価鉄に強い親和性を有するためCOは種々のヘム蛋白質の機能を阻害する.本反応の生成物の一つとしてCOが生ずるが,何故,このCOがヘム分解反応を阻害しないかは興味ある課題であった.そこで今年度は主にこの点について研究を行った.その結果次ぎの事実が知られた.
  1.HO-1とHO-2に結合したヘム鉄の酸素やCOに対する結合能は両者とも殆ど同じであった. 2.酸素親和性はミオグロビンの場合に比べ30-90倍と極めて高かった.これは酸素結合速度はミオグロビンの場合と同じであるが,酸素解離速度が極めて遅いことによるためであった. 3.一方,CO親和性は酸素親和性とほぼ同程度であった. 4.還元型ヒドロヘキシムとの酸素及びCO親和性もヘムの場合と同様の結果であった. 5.ベルドヘムの場合はCO親和性は他のヘム蛋白質に比べ極端に低かった.
  以上の実験事実と,ヘムオキゲシナーゼ反応で生じたCO濃度は反応場での酸素濃度よりも極めて低い事実とを考え合わせると,本反応で生じたCOは本反応を殆ど阻害しない理由が解明出来たことになる.一般のヘム蛋白質ではCO親和性は酸素親和性よりもかなり高いのに対し本酵素に結合したヘムの場合はそうではなかった.この点の解明は今後の大きな課題の一つである., kaken

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• Grant-in-Aid for international Scientific Research, 1996 - 1997, 08044240, Molecular mechanism of heme degradation catalyzed by heme oxygenase, YOSHIDA Tadashi; OLSON John S.; IKEDA-SAITO Masao; MIGITA Taiko; FUJII Hiroshi; ZHOU Hong, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, YAMAGATA UNIVERSITY, 11200000, 11200000, (1) We observed the resonance Raman spectra for alpha-hydroxyheme and verdoheme complexes of heme oxygensae (HO). We found that the ferric alpha-hydroxyheme and ferrous verdoheme complexes showed atypical Raman patterns, which are interpreted. as the result of the symmnetry lowering of the porphyrin-conjugating pi-electron system.
  (2) previously we found that histidine residue of HO was the proximal lignd of heme. To identify the axial heme lignd of HO-2, we prepared His45 to Ala (H45A) and His152 to Ala (H152A) mutants. H45A could form a 1 : 1 complex with hemin but was completely devoid of the heme degradation activity. A 5-coordinate-type ferrous NO EPR spectrum was observed for the heme-H45A complex. On the contrary, H152A mutant exhibited spectroscopic and enzymatic properties identical to those of wild-type. His132 of HO-1, Which corresponds to His152 of HO-2, was also not important for the heme degradation activity.
  (3) The O_2 and CO reactions with the heme, alpha-hydroxyheme, and veroheme complexes of HO were studied. The heme complexs of HO-1 and HO-2 have similar O_2 and CO binding properties. The O_2 affinities for heme and hydroxyheme・are very high, but the CO affinities are only 1-6-fold higher than the O_2 affinities. Thus, HO discriminate much more strongly against CO binding than myoglobin. The CO affinities of the verdoheme complex are about 10,000 times weaker than those of the heme complex. The positive charge on the verdoporphyrin ring causes a large decrease in reactivity of the iron., kaken

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• 基盤研究(C), 1996 - 1996, 08680675, ヘムオキシゲナーゼによるヘム分解の中間過程の解析, 吉田 匡; 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 山形大学, 2200000, 2200000, ミクロソーム酵素であるヘムオキシゲナーゼには二つのイソ酵素があり,HO-1,HO-2と呼ばれている.両酵素ともヘムをヒドロキシヘム,ベルドヘム,ビリベルジン・鉄錯塩を経てビリベルジンに酸化的に分解する.本酵素は単純蛋白質であるが基質であるヘムを結合してできた酵素・基質複合体はヘム蛋白質の性質を持ち,その吸収像はミオグロビンのそれと酷似する.本酵素による反応ではヘムが酸素活性化のための補欠分子族としても機能している.従って,ミオグロビン型のヘムがどのように酵素を活性化できるかは興味深い.私共は先に本酵素にヘムが結合するとき,そのHis25を第五配位子(近位His)とすることを見いだした.然し,酸素の結合や活性化に関与すると思われる第六配位子については種々論議はあるものの未だ特定されていない.
  HO-1,HO-2の両酵素間あるいはそれぞれの酵素の動物種間で高度に保存されている部位があり,そのなかにHis132がある.従ってこのHis132が第六配位子である可能性が高いと推測されてきた.実際,1996年に米国のWilksらによってそうであると報告された.然し私共はその前年にHis132はヘム分解活性には関与していない事を既に報告しているので,再度この食い違いを検討した.
  その結果,やはりHis132は第六配位子ではない事を再確認し,更に両者の相違が何故生じたのかについても検討し以下の見解を得た.His132を他のアミノ酸に換えると大腸菌内で封入体として発現される.その封入体の尿素処理によって得られた再生酵素は本来の高次構造に戻ったもの(活性型)とどこかに異常のあるもの(不活性型)との混合物であったため,Wilksらが誤解したのであろう., kaken

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• 重点領域研究, 1996 - 1996, 08249101, ヘムオキシゲナーゼの構造と機能との関連(特に酸素活性化について), 吉田 匡; 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 山形大学, 2000000, 2000000, ヘムオキシゲナーゼ(HO)はヘムをビリベルジン,CO,鉄に酸化的に分解するミクロソーム酵素である.本酵素によるヘム分解反応では基質であるヘムが酸素活性化のための補欠分子族としても機能しているという特異な反応機構を持つ.反応機構は複雑であり,中間代謝産物としてヒドロキシヘム,ベルドヘム,ビリベルジン・鉄錯塩が存在する.この間の反応は本酵素の上で逐次的に進行し,しかもヒドロキシヘム,ベルドヘムからの反応でもそれぞれ一分子の酸素が消費されるので,三つの連続したモノオキシゲナーゼ反応が一つの酵素蛋白の上で起こっていることになる.
  今回,私共はα-ヒドロキシヘムを化学合成しヘムオキシゲナーゼとの複合体を作り,それら複合体の性質や反応機構を各種生物物理学的測定法を用いて検討した.その結果次の事実が知られた.
  1.酸化型α-ヒドロキシヘムはヒドロキシル基のプロトンが外れたオキソフロリン構造をとっていること.2.酸素に曝すとポルフィリン環が酸化され,構造未知の物質に転換すること.3.この物質に一電子を供給すると速やかにベルドヘムに転換すること.4.還元型ヒドロキシヘムは酸化型とは異なりオキソフロリン構造を取らないこと.5.この還元型に酸素を導入すると速やかにベルドヘムに転換すること.などが知られた.以上の結果から,ヒドロムキシヘムからベルドヘムに至る反応では一当量の還元力と酸素分子が必須であることが知られた.然し,酸素が先か電子が先かについては未だ決着がついていない.
  その他ベルドヘム・HO複合体も作り検討したところ,ベルドヘム・HO複合体の吸収像は私共が以前688nm物質と称した中間体のそれと同じであり,従ってベルドヘムが実際に中間体であることの最終的な結論が得られた., kaken

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• 奨励研究(A), 1995 - 1995, 07740533, ヘム酵素反応中に生成する高酸化鉄ポルフィリン錯体の反応性制御因子の解明, 藤井 浩, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, (財)山形県テクノポリス財団(生物ラジカル研究所), 1200000, 1200000, ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チトクロームP-450の活性反応中間体であるオキソ鉄4価ポルフィリンπ-カチオンラジカル錯体の電子構造をESRにより検討した。HOMO軌道の異なる2種類の錯体について検討した。a2u軌道に不対電子をもつ錯体は、g=4.4、3.6、2.0にシグナルを与えた。このスペクトルは、S=3/2のESRスペクトルであり、鉄4価イオンと不対電子が強磁性相互作用していることが明らかとなった。一方、alu軌道に不対電子をもつ錯体は、g=3.2、2.0にシグナルを与えた。このスペクトルは、錯体が特異な状態をもつことを示唆した。またこのスペクトルは酵素の中間体においても観測されており、今回酵素系の電子構造を人工的な錯体により初めて再現することができたことを示した。これは、この錯体が酵素系を研究する上で有用であることを示すものである。このスペクトルの詳細に解析した結果、先のa2u軌道の錯体と異なり、鉄4価イオンは不対電子とそれほど強く相互作用していないことがわかった。本研究の結果は、今後の酵素系の研究に重要な知見を与えるものである。
  この電子構造の変化が錯体の反応性をどのように変化させるかを、速度論的手法により検討した。錯体とノルボルネンを-80℃で反応させると、エポキシドの生成が観測された。みかけの速度定数に関しては、alu、a2u錯体において大きな変化は観測されなかった。これは、HOMO軌道が反応性を制御していないことを示した。酸化電位による影響、ラジカル性と生成物の関わりは、本年度において十分に行うことができなかったので、今後検討を加え、反応性制御因子の解明をめざす。, kaken

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• Reactivity and selectivity of metalloenzymes relating to biological oxidation reactions, 0, 0, 0, Competitive research funding
• 基盤研究B, Apr. 2022 - Mar. 2025, オキソ配位子のプロトン化による金属ジオキソ錯体の活性化とC-H活性化反応の開発
• 基盤研究B, Apr. 2022 - Mar. 2025, オキソ配位子のプロトン化による金属ジオキソ錯体の活性化とC-H活性化反応の開発