Research Projects

• 基盤研究(C), Apr. 2022 - Mar. 2025, 22K04842, 細胞壁自己消化性酵母を用いたスクアレン回収システムの構築, 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業 基盤研究(C), 奈良女子大学, 4290000, 3300000, 990000, kaken

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• Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research, 01 Apr. 2012 - 31 Mar. 2014, 24658289, Engineering of a hydrocarbon producing yeast for biofuel production, KAGIWADA Satoshi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nara Women's University, 3380000, 2600000, 780000, A unicellular green algae, Botryococcus braunii, secretes a hydrocarbon called botryococcene, which is very suitable for biofuel production, into its environment. However, Botryococcus do not grow fast and is not subjected to biotechnological engineering, making it difficult to improve this organism for more efficient biofuel production.
  In this study, genes required for botryococcene synthesis are incorporated into the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, which is very suitable for biotechnological engineering, to make a yeast strain which can prouduce large amounts of botryococcene and secrete them., kaken

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• 萌芽研究, 2003 - 2004, 15657016, 海洋微生物ラビリンチュラのドコサヘキサエン酸生成に関する細胞学的解析, 野口 哲子; 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 3200000, 3200000, ラビリンチュラ類は卵菌と不等毛植物の特徴を持つ汽水域に生息する単細胞生物である。Schizochytrium limacinum 21株(SR21株)は多量の脂肪酸を細胞内に蓄積し、なかでも高度不飽和脂肪酸のドコサヘキサエン酸(DHA)を多量に生成する微生物として、近年注目されている。本研究では、SR21株のDHA生成を細胞学的に解析した。まず、SR21株の同調培養系を確立し、100%の遊走子群を得た。この系を用い、遊走子及び遊走子着床後4、8、12、24時間、10日目の栄養細胞で、オイルボディーの形成過程を形態学的に観察し、それに伴う脂質量、及び脂肪酸組成の変化を解析した。
  Nile red染色によって生活史の全ての時期にオイルドロップが観察されたが、オイルドロップは遊走子着床後の細胞成長に伴って大きくなり、細胞当たりの数も増加した。電子顕微鏡観察では、パルミチン酸を1、3位に、DHAを2位に持つトリアシルグリセロール(TG)の結晶様構造による縞模様を呈するオイルボディーが観察された。このタイプのオイルボディーは遊走子では余り観察されず、成長中の細胞で出現し、12時間目で細胞質の1/2以上を占めた。成長中の細胞では、小さなオイルボディーが小胞体に接し、小胞体内には観察されないため、オイルボディーは小胞体上で合成されると考えられた。
  細胞生長に伴い細胞当たりの脂質量も増加したが、総脂肪酸中のDHAの比率は24時間目以降低下した。そこで脂質を、主にオイルボディーの構成成分であるTGと生体膜成分であるホスファチジルコリン(PC)に分画し、それぞれの脂肪酸組成を解析した。その結果、遊走子及び着床後24時間目の細胞では、PCにおけるDHAの脂肪酸組成がおよそ60%であったのに対し、10日後には10%以下に低下した。一方、TGではDHAの脂肪酸組成に大きな変動は認められなかった。, kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (C), 2001 - 2002, 13640665, Cytological studies on the mechanism of hydrocarbon synthesis by a green alga, Botryococcus braunii, NOGUCHI Tetsuko; KAGIWADA Satoshi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nara women's University, 3400000, 3400000, The colonial green alga Botryococcus braunii produces unusually high levels of hydrocarbons, amounting to 30%-60% of its dry weight, and accumulates them around the cell surfaces. Usually, the hydrocarbon synthesis occurrs just after cell division but before the formation of polysaccharide cell wall. In this study, we developed the induction-system of interphase cells into an active hydrocarbon synthesis. Active hydrocarbon synthesis occurred after the digestion of cell walls in interphase cells (spheroplasts), but didn't occur by the removal of already accumulated hydrocarbons. Maximally, we could induce 12 times of hydrocarbon synthesis by spheroplasts than those by normal interphase cells. The morphologies of Golgi bodies and the trans-Golgi networks (TGN) in spheroplasts were not similar to those in normal interphase cells, but those in cells just after cell division. The result strongly supports our hypothesis that the TGN is participated in the hydrocarbon synthesis. Then, we have isolated a cDNA coding for β-COP that is a coat-protein of transport vesicles mediating the vesicular transport through the Golgi apparatus and the TGN. The cDNA encodes a protein of 947 amino acids with a predicted molecular mass of 109 kDa. Immunoelectron microscopic analysis was also carried out with the anti-body against β-COP. To produce spheroplasts of B. braunii, we examined the polysaccharide and sugar compositions of the cell wall, and it was clarified that B.braunii had a characteristic one., kaken

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• 奨励研究(A), 2000 - 2001, 12780474, 酵母のイノシトールリン脂質の低温耐性および細胞内膜小胞輸送における役割の解明, 鍵和田 聡, 日本学術振興会, 科学研究費助成事業, 奈良女子大学, 2400000, 2400000, 酵母(Saccharomyces cerevisiae)のSCS2遺伝子産物は、細胞内膜小胞輸送に関与する膜蛋白質であるシナプトブレビンに結合する蛋白質としてラットやマウスなどで発見されたVAP-33と相同性がある。一方、この遺伝子を破壊した酵母はイノシトール要求性や低温耐性を示す。これらの表現型と他の遺伝子との遺伝学的相互作用の結果から、SCS2遺伝子破壊株ではイノシトールリン脂質の代謝に異常があり、それが結果として低温耐性を引き起こすと考え、この関係の分子的要因を明らかにするためにSCS2遺伝子産物の機能解明を試みた。
  本研究ではまずSCS2破壊株のイノシトール要求性を与える要因を明らかにしようとし、SCS2破壊株では酵母のイノシトール生合成に必須の遺伝子であるINO1遺伝子の発現量が野性株に比べて明らかに低下していたこと、しかし、外来プラスミドに挿入したINO1プロモーターからの遺伝子発現はほぼ正常であったことを明らかにした。このことから、SCS2遺伝子産物は染色体に働きかけてINO1プロモーターからの遺伝子発現を正に調節するタンパク質であることが示唆された。一方、SCS2遺伝子破壊株のイノシトール要求性は、ホスファチジルコリン生合成のためのCDPコリン経路に位置する遺伝子を破壊すると回復するが、もうひとつのPC生合成経路であるPEメチル化経路を破壊しても回復しないことを明らかにした。
  また、SCS2破壊株のリン脂質と中性脂質組成を調べたところ、この破壊株には他のリン脂質代謝変異株に見られたような野性株との大きな相違は観察されなかった。ただし、34℃で生育させたときにイノシトールの代謝が盛んになることを明らかにしたことから、SCS2岐壊株でみられた高温感受性のイノシトール要求性は高温でのイノシトール代謝昂進にイノシトール生合成が追いつかなくなったためと推測された。, kaken

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• Grant-in-Aid for Scientific Research (C), 1999 - 2000, 11640664, Hydrocarbon synthesis in a green alga, Botryococcus braunii., NOGUCHI Tetuko; KAGIWADA Satoshi, Japan Society for the Promotion of Science, Grants-in-Aid for Scientific Research, Nara Women's University, 3000000, 3000000, The green alga Botryococcus. braunii produce unusually high levels of hydrocarbons, 15-75% of the cell dry weight It makes B.braunii as excellent candidate for a renewable source of liquid hydrocarbon fuel as a "solar oil". In this study, the mechanism of hydrocarbon synthesis was studied cytologically. The structure of hydrocarbons was examined by gas chromatography mass spectrometer. They were straight odd number_7 C_<29> (35%) and C_<31> (26%) chains with two double bonds. The stage of hydrocarbon synthesis during the cell cycle was determined by the incorporation of [1-^<14>C] acetate into hydrocarbons and the observations on ultrastructures of cell organelle by the cryo-freezing/freeze-substitution for electron microscopy. The results showed that the hydrocarbon synthesis occurred just after cell division but before cell wall formation. When the hydrocarbon synthesis occurs, the trans-Golgi networks produced special very large vesicles that contained fine fibrils and several masses of electron-dense substance. Cytochalasin B treatment results the appearance of hydrocarbon droplets outside the plasma membrane of cells just after cell division, which showed that the hydrocarbon synthesis occurs on the plasma membrane., kaken

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• 生体膜の構造と機能に関する分子生物学的研究, 0, 0, 0, Competitive research funding
• Structure and function of biomembrane, 0, 0, 0, Competitive research funding